高去酰胺蛋白酶產生菌的誘變選育及產酶條件優(yōu)化

那治國，馬永強*，韓春然，石彥國

(1.黑龍江東方學院食品與環(huán)境工程學部，黑龍江 哈爾濱 150086；

2.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

高去酰胺蛋白酶產生菌的誘變選育及產酶條件優(yōu)化

那治國1，馬永強2,*，韓春然2，石彥國2

(1.黑龍江東方學院食品與環(huán)境工程學部，黑龍江 哈爾濱 150086；

2.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

以地衣芽孢桿菌2709為出發(fā)菌株，采用氮離子注入技術，在最佳注入劑量為1.5×1015ions/cm2的條件下進行誘變處理，篩選得到一株去酰胺度高達48.99%的突變株SDL-9，去酰胺度提高了85.57%，而肽鍵水解度相對較弱。并對SDL-9的產酶條件進行優(yōu)化，結果表明：最佳碳源為質量濃度為2.0g/100mL的玉米粉，最佳氮源為質量濃度3.0g/100mL的大豆蛋白，質量濃度為0.04g/100mL Fe3+對產酶具有明顯的促進作用，質量濃度為0.9g/100mL谷氨酰胺對產酶有明顯的誘導作用，最佳起始pH值為7.0，最佳發(fā)酵溫度35℃，在此條件下進行發(fā)酵產酶，測得去酰胺度為57.1%，肽鍵水解度為13.2%。

氮離子注入；去酰胺；堿性蛋白酶

離子注入技術是20世紀80年代興起的一種材料表面處理技術。1986年中國科學院等離子體物理所余增亮發(fā)現N+離子注入水稻種子的誘變作用，證實了質量(粒子)沉積生物效應的存在，開辟了低能離子與物質相互作用這一新的研究方向[1-2]，是育種方法學的重要創(chuàng)新并從國內走向世界。它與傳統(tǒng)的誘變源如X射線、γ射線、UV射線以及化學誘變劑相比，離子注入除有能量沉積外，還有動量傳遞、質量沉積及電荷交換等效應[3-4]，所以離子束注入技術是一種集理化誘變因子于一體的綜合技術方法，具有高效、高定向性、損傷輕、突變譜廣的特點[5-6]。經過多年努力，該技術在植物、動物和微生物品種改良上取得了良好效果[7-9]，為生物的遺傳改良開辟了一條新的途徑，引起了國內外學者的廣泛關注。

去酰胺是近年來在蛋白改性研究中備受關注的研究課題之一，由于蛋白肽鏈上的酰胺基對蛋白質的高級結構形成的貢獻率較高，所以對蛋白質的溶解性、乳化性性等具有重要影響。由此，研究者希望能通過部分脫除蛋白肽鏈上的酰胺基，達到改善蛋白質某些功能特性的目的。常用的去酰胺改性方法包括物理方法、化學方法和生物酶法。由于物理方法和化學方法在去酰胺改性上存在一定的不足[10-13]，而隨著酶工業(yè)、固定化酶技術和膜反應器的不斷發(fā)展，酶解過程更趨于自動化、簡單化，酶法去酰胺改性已成為一種趨勢。在酶法去酰胺改性中，常用的酶有木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、轉谷氨酰胺酶以及微生物堿性蛋白酶等，由于動物蛋白酶、植物蛋白酶存在提取生產復雜，價格昂貴等缺點，而微生物堿性蛋白酶雖然具有原料來源低廉、安全性高等優(yōu)點，但現有的堿性蛋白酶去酰胺能力普遍不高，所以去酰胺改性的應用受到了限制[14-15]。因此，隨著我國大豆蛋白產業(yè)的發(fā)展，應用誘變技術篩選高去酰胺活性堿性蛋白酶產生菌顯得尤為重要。本研究采用氮離子注入技術對地衣芽孢桿菌進行誘變處理，篩選高去酰胺活性堿性蛋白酶產生菌，并優(yōu)化其產酶條件，以期為高去酰胺活性堿性蛋白酶的發(fā)酵生產及應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

地衣芽孢桿菌2709(Bacillus licheniformis2709) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(編號10266)。

平板培養(yǎng)基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、瓊脂1.5g、蒸餾水100mL，pH7.2。種子培養(yǎng)基：牛肉膏1.0g、蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、蒸餾水100mL，pH7.0～7.2?；A發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.0g、麩皮1.0g、黃豆餅粉2.0g、酵母膏2.0g、Na2HPO40.2g、KH2PO40.1g、CaCO31.0g、蒸餾水100mL，pH7.0～7.2。

1.2 試劑與儀器

大豆分離蛋白(A型) 哈高科大豆食品有限責任公司；茚三酮(分析純) 北京亞太龍興化工有限公司；甘氨酸 天津市大陸化學試劑廠；谷氨酰胺 中國惠世生化試劑有限公司。

多功能等離子體浸沒離子注入裝置 哈工大材料科學與工程學院研制；UDK152型全制動凱氏定氮儀 意大利威爾普公司；KYC-100型恒溫搖床 北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；CL-32L自動高壓滅菌器 日本ALP公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的發(fā)酵產酶

將供試菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數生長期后作為種子液，以體積分數2%的接種量接種于裝有30mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，于30℃、140r/min搖床發(fā)酵48h后，10000r/min離心10min，取上清液，即得粗酶液。

1.3.2 氮離子注入誘變處理

菌膜的制備：將活化后的地衣芽孢桿菌2709，在30℃、140r/min條件液體種子培養(yǎng)到對數增殖期中期后，制成細胞濃度約為108個/mL的菌懸液。取0.4mL菌懸液采用無菌操作，涂布于滅菌的小鋁盒(直徑2cm)內，無菌室下自然風干后立即進行氮離子注入誘變處理。

氮離子注入誘變處理：將菌膜放入氮離子注入機中，在真空度為6.0×10-1Pa，注入能量為25keV，注入劑量為0.5×1015～2.5×1015ions/cm2的條件下進行氮離子注入處理，同時做真空對照。誘變后用無菌脫脂棉，蘸無菌生理鹽水，仔細擦帶菌株的小鋁盒，將脫脂棉放入5mL含玻璃珠無菌生理鹽水中，振蕩器振蕩3min，得到誘變后的菌懸液。最后按平板菌落計數法，進行梯度稀釋、涂布培養(yǎng)，菌落計數。計算不同注入劑量的致死率，繪制致死率曲線，從中選取最佳注入劑量。

1.3.3 篩選方法

將誘變后的菌懸液涂布在平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48～60h，挑選形態(tài)好的單菌落，分別接種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，30℃、140r/min條件下富集培養(yǎng)18h后，按1.3.1節(jié)方法發(fā)酵產酶，制得粗酶液，以去酰胺度和肽鍵水解度為指標，挑選去酰胺能力強而肽鍵水解能力弱的菌株。

篩選標準：以出發(fā)菌株為對照，去酰胺度(DD)提高率≥0%，而肽鍵水解度(DH)相對較低的為正突變株；去酰胺度(DD)提高率≤10%為負突變株；去酰胺度(DD)提高率在0%～10%的為非突變株。

1.3.4 遺傳穩(wěn)定性考察

為了確保篩選到的高去酰胺菌株具有遺傳穩(wěn)定性，對氮離子注入誘變后得到的突變株SDL-9進行遺傳穩(wěn)定性考察。每代實驗過程：突變菌株→平板分離→單菌落→斜面→種瓶→搖瓶發(fā)酵產酶，制得粗酶液，測定去酰胺度和肽鍵水解度，并與各自初代進行比較。共傳5代，每代均做3個平行。

1.3.5 突變菌株SDL-9產酶條件的優(yōu)化

將突變菌株SDL-9進行種子培養(yǎng)后，按1.3.1節(jié)方法發(fā)酵產酶，制得粗酶液。以去酰胺度和肽鍵水解度為指標，研究不同培養(yǎng)基對產酶的影響，并以玉米粉添加量(A)、大豆蛋白添加量(B)、Fe3+添加量(C)、谷氨酰胺添加量(D)為因素，分別選取3個水平，以去酰胺度為指標，采用L9(34)正交試驗確定最優(yōu)產酶培養(yǎng)基，同時，采用單因素試驗研究起始pH值及發(fā)酵溫度對產酶的影響，確定最優(yōu)產酶條件。

1.3.6 肽鍵水解度(DH)的測定

參照文獻[16]方法進行測定。

1.3.7 去酰胺度(DD)的測定

采用微量彌散皿法，具體操作參照文獻[17]方法。

1.3.8 蛋白質含量的測定

采用半微量凱氏定氮法[18]。

2 結果與分析

2.1 種子生長曲線

將活化后的出發(fā)菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃、140r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)30h，每2h取樣測定發(fā)酵液在600nm波長處的光密度值，繪制種子生長曲線。由圖1可見，地衣芽孢桿菌2709的對數生長期為14～22h。

圖1 地衣芽孢桿菌2709生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus licheniformis 2709

2.2 氮離子注入誘變選育高去酰胺活性堿性蛋白酶產生菌

2.2.1 不同注入劑量對菌株的影響

圖2 氮離子注入劑量的致死率曲線Fig.2 Lethal rate curve of Bacillus licheniformis 2709 under different doses of nitrogen ion implantation

采用不同注入劑量0.5×1015～2.5×1015ions/cm2，進行氮離子注入誘變，平板培養(yǎng)后菌落計數，同時做真空對照，計算不同劑量下的致死率，結果見圖2。

如圖2所示，實驗菌株在經過離子注入后呈現致死率隨注入劑量先上升后下降，最后再上升的趨勢，這種現象是符合離子注入誘變“馬鞍型”劑量-效應曲線的。由于最佳的注入劑量應該在致死率曲線波谷區(qū)域，故地衣芽孢桿菌2709的最佳注入劑量為1.5×1015ions/cm2。

2.2.2 氮離子注入誘變的篩選結果

在真空度為6.0×10-1Pa，注入能量為25keV，注入劑量為1.5×1015ions/cm2的條件下進行氮離子注入誘變。經平板培養(yǎng)、發(fā)酵產酶，以去酰胺度和肽鍵水解度為指標，對突變株進行篩選，部分結果如表1所示。

表1 氮離子注入誘變篩選結果Table 1 Screening results of mutant strains resulting from nitrogen ion implantation

由表1可見，經氮離子注入誘變后，有28株突變株的去酰胺度提高10%以上，但其中突變株SDL-17、SDL-49、SDL-101和SDL-104的肽鍵水解度相對較高，根據篩選標準，這4株菌不屬于正突變株，所以共有24株菌為正突變株。并且正突變中有4株(SDL-1、SDL-7、SDL-8、SDL-9)的去酰胺度提高了60%以上，其中突變株SDL-9的去酰胺度高達48.99%，比出發(fā)菌株的去酰胺度提高了85.57%?？梢?，氮離子注入的誘變方法在誘變地衣芽孢桿菌產高去酰胺活性堿性蛋白酶上是一種較高效率的誘變手段。

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性考察

為了確定突變株SDL-9是否具有產高去酰胺活性堿性蛋白酶的遺傳穩(wěn)定性，做了斜面培養(yǎng)基的傳代穩(wěn)定性實驗，結果見表2。

表2 遺傳穩(wěn)定性比較Table 2 Genetic stability of SDL-9

從表2可以看出，在實驗傳5代范圍內，突變株SDL-9具有良好的遺傳穩(wěn)定性，去酰胺度變化范圍在99%～104%之間，肽鍵水解度變化范圍在100%～126%之間。

2.3 突變菌株SDL-9產酶條件優(yōu)化

2.3.1 不同碳源對產酶的影響

分別以質量濃度為1.0g/100mL的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉和玉米粉作為碳源，發(fā)酵產酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結果見圖3。

圖3 不同碳源對產去酰胺蛋白酶的影響Fig.3 Effect of carbon source type on the production of protease

由圖3可知，以玉米粉作為碳源時產酶的去酰胺度最高，其次為可溶性淀粉，且前者的肽鍵水解度略低于后者。同時還可以看出，易利用碳源如葡萄糖、麥芽糖等作為碳源時對產酶有一定的抑制作用，產酶的去酰胺度和肽鍵水解度都較低，這可能是由于代謝產物的阻遏作用?？紤]到要選擇的是去酰胺能力強，而肽鍵水解能力弱的產酶條件，所以選擇玉米粉為發(fā)酵產酶碳源。

2.3.2 不同氮源對產酶的影響

圖4 不同氮源對產去酰胺蛋白酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source type on the production of protease

分別以質量濃度為2.0g/100mL的硫酸銨、牛肉膏、大豆蛋白、酪素、黃豆餅粉及蛋白胨為氮源，發(fā)酵產酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結果見圖4。

由圖4可知，不同氮源對堿性蛋白酶的去酰胺能力和肽鍵水解能力的貢獻不同。以牛肉膏作為氮源的去酰胺度最高為50.58%，其次是大豆蛋白為50.24%，而以大豆蛋白為氮源的肽鍵水解度要低于以牛肉膏為氮源的，而又考慮到大豆蛋白的生產規(guī)模大、價格低等因素，所以選擇大豆蛋白作為發(fā)酵產酶氮源。

2.3.3 不同金屬離子對產酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質量濃度為0.02g/100mL的不同金屬離子，發(fā)酵產酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結果見圖5。

圖5 金屬離子對產去酰胺蛋白酶的影響Fig.5 Effect of metal ions on the production of protease

由圖5可知，Ca2+、Fe3+對菌種產酶的去酰胺能力有明顯的促進作用，其中Fe3+對菌種產酶的肽鍵水解能力有一定的抑制作用；而Cu2+對菌種產酶的去酰胺能力有明顯的抑制作用；另外，Mg2+、Mn2+、Zn2+對菌種產酶的去酰胺能力和肽鍵水解能力無明顯影響，故選擇金屬離子Fe3+考察其對產酶的影響。

2.3.4 誘導物谷氨酰胺對產酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入質量濃度為0.9g/100mL的谷氨酰胺最為誘導物，發(fā)酵產酶，以未加誘導物為對照，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結果見圖6。

圖6 谷氨酰胺對產去酰胺蛋白酶的影響Fig.6 Effect of glutamine on the production of protease

由圖 6 可知，谷氨酰胺對菌株產酶的去酰胺能力有明顯促進作用，并隨著添加量的增加而增大，到0.9g/100mL時去酰胺度達到最高為55.61%，以后變化不明顯；但谷氨酰胺誘導物對其肽鍵水解度的影響不顯著。

2.3.5 正交試驗優(yōu)化產酶培養(yǎng)基配方

表3 L9(34)正交試驗結果Table 3 Orthogonal array design and results

從表3極差(R)的結果可以看出，各因素對發(fā)酵產酶去酰胺度的影響程度為A＞D＞B＞C，即玉米粉添加量＞谷氨酰胺添加量＞大豆蛋白添加量＞Fe3+添加量，最優(yōu)水平組合為A2B3C2D3，此組合在上述9個試驗組中未出現，故需在此條件下進行發(fā)酵產酶的驗證實驗，測得A2B3C2D3組合條件下酶液的去酰胺度為56.9%，比試驗組4號的去酰胺度56.2%略高，故確定高去酰胺蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D3，即玉米粉(碳源)添加量為2g/100mL，大豆蛋白(氮源)添加量為3g/100mL，Fe3+添加量為0.04g/100mL，谷氨酰胺(誘導物)添加量為0.9g/100mL。

2.3.6 起始pH值對產酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調節(jié)為4～10，發(fā)酵產酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結果見圖7。

圖7 起始pH值對產去酰胺蛋白酶的影響Fig.7 Effect of initial fermentation pH on the production of protease

由圖7可知，培養(yǎng)基起始pH值對發(fā)酵產酶的去酰胺度和肽鍵水解度影響較大，pH值為7時去酰胺度最高，pH值為6～8時肽鍵水解度較高，且相差不大?？紤]到要選擇的是去酰胺能力強而肽鍵水解能力弱的發(fā)酵條件，所以培養(yǎng)基起始pH值為7.0時產酶效果最好，為最適pH值。

2.3.7 發(fā)酵溫度對產酶的影響

按照以上得到的結果，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于25～55℃條件下發(fā)酵產酶，測定其去酰胺度和肽鍵水解度，結果見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對產去酰胺蛋白酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on the production of protease

發(fā)酵溫度能夠顯著影響微生物的生長速率和代謝途徑，過高或過低的培養(yǎng)溫度都會影響生物體內的活性，從而影響產物的合成。由圖8可見，發(fā)酵溫度為35℃時去酰胺度最高，而肽鍵水解度相對較低，故為最適發(fā)酵溫度。

3 結 論

采用氮離子注入技術，以地衣芽孢桿菌2709為出發(fā)菌株，在試驗確定的最佳注入劑量(1.5×1015ions/cm2)的條件下進行誘變處理，篩選獲得了一株所產堿性蛋白酶的去酰胺能力有顯著提高的菌株SDL-9，去酰胺度高達48.99%，比誘變前提高了85.57%，而肽鍵水解度相對較弱，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

以去酰胺度和肽鍵水解度為指標，采用單因素試驗和正交試驗對突變菌株SDL-9發(fā)酵產酶條件進行了優(yōu)化，結果表明：最佳碳源為2.0g/100mL玉米粉，最佳氮源為3.0g/100mL大豆蛋白，0.04g/100mL的Fe3+對產酶具有明顯的促進作用，在培養(yǎng)基中添加0.9g/100mL的谷氨酰胺對產高去酰胺堿性蛋白酶具有明顯的誘導作用，最佳起始pH7.0，最佳發(fā)酵溫度35℃，在此條件下進行發(fā)酵產酶，測得去酰胺度為57.1%，肽鍵水解度為13.2%。

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Breeding of Strain Producing Protease with High Deamidation and the Optimization of Fermentation Conditions

NA Zhi-guo1，MA Yong-qiang2,*，HAN Chun-ran2，SHI Yan-guo2
(1. Department of Food and Environmental Engineering, East University of Heilongjiang, Harbin 150086, China；
2. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The original strainBacillus licheniformis2709 was mutagenized by means of nitrogen ion implantation at the optimal implantation dose of 1.5 × 1015ions/cm2. As a result, a mutant strain with a deamidation capacity of 48.99% (increased by 85.57% compared with the original strain) but a relatively weak ability to cleave peptide bonds named as SDL-9 was obtained. The orthogonal array design method was used for the optimization of fermentation conditions for production of alkaline protease with high deamidation capacity by SDL-9. The optimal fermentation conditions were 2 g/100 mL corn meal as the carbon source, 3 g/100 mL soybean protein as the nitrogen source, 0.04 g/100 mL Fe3+with distinct promoting effect on enzyme production, 0.9 g/100 mL glutamine that could notably induce enzyme production, initial pH 7.0, and temperature 35 ℃. Under these conditions, the deamidation capacity and hydrolysis degree of peptide bonds were 57.1% and 13.2%, respectively.

nitrogen ion implantation；deamidation；alkaline protease

Q939.97

A

1002-6630(2012)01-0174-06

2011-09-30

國家“863”計劃項目(2006AA10Z329)

那治國(1980—)，男，講師，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：nazhiguo1980@126.com

*通信作者：馬永強(1963—)，男，教授，碩士，研究方向為食品化學。E-mail：mayq@hrbcu.edu.cn