• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽工藝參數(shù)優(yōu)化

    2012-04-01 07:39:41郭奇亮陳代文鄒沫君
    食品科學(xué) 2012年1期
    關(guān)鍵詞:降血壓物質(zhì)量抑制率

    李 誠(chéng),郭奇亮,2,付 剛,陳代文,鄒沫君

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625000;2.成都市農(nóng)林科學(xué)院,四川 成都 611130)

    酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽工藝參數(shù)優(yōu)化

    李 誠(chéng)1,郭奇亮1,2,付 剛1,陳代文1,鄒沫君1

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625000;2.成都市農(nóng)林科學(xué)院,四川 成都 611130)

    為獲得具有較高降血壓活性的降血壓肽,選用胰蛋白酶對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行水解。以水解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率為指標(biāo),先進(jìn)行單因素試驗(yàn),確定底物質(zhì)量濃度、水解溫度、pH值、酶用量及水解時(shí)間5個(gè)因素的最適水平范圍,再通過正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的最佳酶解條件為:底物質(zhì)量濃度10g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、水解時(shí)間8h、酶用量2000U/g,此時(shí)酶解產(chǎn)物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制率為68.74%。

    降血壓肽;豬血紅蛋白;胰蛋白酶;酶解工藝

    高血壓病是一種常見的多發(fā)病。據(jù)估計(jì),目前世界1/4的成年人患有高血壓,這一數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)到2025年會(huì)增加到30%[1]。全球范圍內(nèi)約有760萬(wàn)人由于高血壓病早逝,約占全球病死率13.5%;由高血壓引起的腦卒中和缺血性心臟病分別達(dá)54%和47%[2]。藥物治療高血壓病雖然可以起到一定的作用,但是藥物具有強(qiáng)烈的副作用,嚴(yán)重影響著人們的身心健康。人們迫切希望找到一種可以代替藥物的食源性降血壓產(chǎn)品。

    血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptides,ACEIP)又稱ACE抑制肽,是一類具有降血壓作用的多肽的總稱。ACEIP的突出優(yōu)點(diǎn)是能有效降低原發(fā)性高血壓患者的血壓,而對(duì)正常人卻沒有降血壓作用,也不會(huì)產(chǎn)生其他副作用。早在1965年,國(guó)外學(xué)者Ferreira[3]首次從巴西蝮蛇蛇毒中分離出具有ACE抑制活性的多肽,1982年,Maruyama等[4]發(fā)現(xiàn)利用胰蛋白酶酶解酪蛋白之后的產(chǎn)物具有體外ACE抑制活性。隨后,越來越多的研究人員分別從不同的食物蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到具有降血壓活性的多肽,報(bào)道的食物有螃蟹、牛肉、蛋黃、玉米等[5-8]。豬血紅蛋白經(jīng)酶解制備的多肽不僅具有易溶解、低黏度、抗凝膠形成等良好的功能特性,而且具有降血壓、降血脂、抗衰老、提高免疫力、緩解心血管疾病以及肥胖癥等重要的生理活性[9]。Mito等[10]等用胃蛋白酶酶解豬血紅蛋白得到了抗高血壓肽;Man Jin等[11]依次用外肽酶Flvourzyme和內(nèi)肽酶Esperase水解豬的血紅蛋白得到富含亞鐵血紅素的低分子質(zhì)量的小肽;有研究表明豬血經(jīng)胰蛋白酶水解得到可增強(qiáng)機(jī)體免疫活性的多肽[12]。酶解制備降血壓肽的研究報(bào)道比較多,但各研究所用酶的種類、酶解參數(shù)(特別是酶的用量)及酶解效果差異比較大。

    本研究采用胰蛋白酶對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行水解,對(duì)降血壓肽制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以期在較少酶用量情況下獲得具有較高降血壓活性的降壓肽,為利用豬血紅蛋白制備、開發(fā)降血壓肽提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    新鮮豬血 雅安市大興屠宰場(chǎng)。

    胰蛋白酶(Trypsin,酶活力1:250) 美國(guó)Amresco公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酸-組氨酸-亮氨酸(HHL) 美國(guó)Sigma公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BR4i型多功能冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司;BT-12S電子天平 德國(guó)Sartorius公司;PHS-3C酸度計(jì)方舟科技公司。

    1.3 方法

    1.3.1 豬血紅蛋白的制備

    本實(shí)驗(yàn)改良Zhao Qiuyu等[13]的方法。在屠宰過程中采集血液(按3g/L加入檸檬酸鈉抗凝),于低溫條件下(冰塊降溫)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷藏。在4℃條件下將血液9000×g高速冷凍離心10min,得到上層血漿和下層血細(xì)胞。棄去血漿,將血細(xì)胞加入同等體積的生理鹽水沖洗并離心兩次后加入等體積去離子水,在不斷攪拌下超聲波處理20min輔助溶血,之后4℃條件下4000×g冷凍離心10min,得到上清血紅蛋白液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 酶解條件優(yōu)化

    胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽基本過程:按設(shè)定的底物質(zhì)量濃度取豬血紅蛋白液,根據(jù)不同的反應(yīng)條件調(diào)節(jié)溫度、pH值和酶加入量,水解至設(shè)定的時(shí)間,最后沸水浴10min滅酶。在4℃、10000×g離心5min,收集濾液備用。另取豬血紅蛋白用去離子水溶解,作為非酶解對(duì)照液。

    1.3.2.1 酶解條件單因素試驗(yàn)

    分別考察底物質(zhì)量濃度、水解溫度、pH值、酶用量、水解時(shí)間5個(gè)因素對(duì)豬血紅蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制率和水解度的影響。底物質(zhì)量濃度的影響:設(shè)定豬血紅蛋白質(zhì)量濃度4、6、8、10、12g/100mL,其他條件為溫度45℃、pH8.0、酶用量6000U/g、水解時(shí)間6h。水解溫度的影響:設(shè)定水解溫度35、40、45、50、55℃,其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、pH8.0、酶用量6000U/g、水解時(shí)間6h。pH值的影響:設(shè)定pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、酶用量6000U/g、水解時(shí)間6 h。酶用量的影響:設(shè)定酶用量:2 00 0、4000、6000、8000、10000U/g,其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、水解時(shí)間6h。水解時(shí)間的影響:設(shè)定水解時(shí)間2、4、6、8、10h,其他水解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解溫度45℃、pH8.0、酶用量6000U/g。

    1.3.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

    在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,按五因素四水平L16(45)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),以蛋白質(zhì)水解物ACE抑制率為指標(biāo),研究最佳酶解條件。

    1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

    1.3.3.1 豬血紅蛋白液的蛋白質(zhì)含量測(cè)定

    參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法測(cè)定。

    1.3.3.2 蛋白酶活力測(cè)定

    參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》中的福林法測(cè)定,根據(jù)蛋白酶活力確定加酶量。

    1.3.3.3 ACE抑制率測(cè)定

    參照Cushman等[14]的方法。

    1.3.3.4 蛋白質(zhì)水解度測(cè)定

    采用甲醛滴定法[15]。

    1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS12.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的ACE抑制率和水解度采用二變量Pearson相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)極差分析各個(gè)酶解參數(shù)水平變化對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率影響的主次順序;用方差分析各個(gè)因素對(duì)胰蛋白酶水解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率影響的顯著性;采用處理間多重比較法(LSD法)分析各個(gè)因素間的相互作用,確定最佳酶解因素水平組合。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 底物質(zhì)量濃度的影響

    圖1 底物質(zhì)量濃度對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

    由圖1可知,隨著底物質(zhì)量濃度的增加,胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度和水解產(chǎn)物的ACE抑制率都上升。底物質(zhì)量濃度從4~12g/100mL,質(zhì)量濃度每增加2g/100mL,水解度分別增加2.43%、0.75%、0.79%和0.62%,產(chǎn)物ACE抑制率的增長(zhǎng)分別為4.14%、3.57%、2.88%和1.27%。隨著底物質(zhì)量濃度增加,雖然水解度和產(chǎn)物ACE抑制率都有增加,但是增加的幅度越來越小。底物質(zhì)量濃度從10g/100mL增加到12g/100mL時(shí),其水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的增加幅度最小,因此確定10g/100mL及以下為最適宜的底物質(zhì)量濃度。

    2.2 水解溫度的影響

    圖2 水解溫度對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

    由圖2可知,水解度與產(chǎn)物ACE抑制率都是先上升后下降,并且都是在溫度為40~45℃間達(dá)到峰值,40~45℃為最適宜溫度。當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí),水解度和產(chǎn)物ACE抑制率已經(jīng)大幅下降。因此選擇35、40、45℃和50℃為適宜的水解溫度。

    2.3 pH值的影響

    圖3 pH值對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

    由圖3可知,在pH8.0時(shí)酶解水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率都達(dá)到峰值。而pH6.0時(shí),水解度和產(chǎn)物ACE抑制率是所有條件下最低的,故選擇pH值為7.0、8.0、9.0和10.0為適宜的酶解條件。

    2.4 酶用量的影響

    圖4 酶用量對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

    由圖4可知,隨著酶用量的增加,胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率都上升。隨著酶用量的繼續(xù)增加,水解度的增加比較平緩,而產(chǎn)物ACE抑制率一直保持著較高增長(zhǎng)率??紤]酶用量的增加導(dǎo)致成本增加,因此選擇2000、4000、6000U/g和8000U/g為適宜的酶用量。

    2.5 水解時(shí)間的影響

    圖5 水解時(shí)間對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白水解度及產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin

    由圖5可知,在酶解前期,酶解水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率都快速上升,而從6h開始,水解度和產(chǎn)物的ACE抑制率增長(zhǎng)速度趨于平緩,8h后增長(zhǎng)幅度不大。因此選擇2、4、6h和8h為適宜的水解時(shí)間。

    2.6 酶解條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

    2.6.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果與分析分別見表1~3。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in orthogonal array design

    表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and results

    表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

    根據(jù)表2極差分析,各因素對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率影響的主次順序依次為C>A>D>B>E,即pH值>底物質(zhì)量濃度>水解時(shí)間>水解溫度>酶用量。從表3的方差分析可以看出,底物質(zhì)量濃度、水解溫度、pH值、水解時(shí)間4個(gè)因素對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率的大小均有極顯著的影響,酶用量對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率的大小無顯著影響,區(qū)組間影響差異不顯著。

    2.6.2 各試驗(yàn)處理平均數(shù)多重比較(LSD法)

    表3結(jié)果顯示,除酶用量對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率無顯著影響外,其他4個(gè)因素都有極顯著影響。因此有必要進(jìn)行各個(gè)試驗(yàn)處理間的多重比較以確定最優(yōu)水平組合。根據(jù)最小顯著差數(shù)法計(jì)算各處理每?jī)山M間的差值和最小顯著差數(shù)LSDα:LSD0.05=2.84,LSD0.01=3.91。

    多重比較結(jié)果表明,除幾個(gè)試驗(yàn)組間(包括試驗(yàn)組11號(hào)與4號(hào),試驗(yàn)組16號(hào)與5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、13號(hào),試驗(yàn)組13號(hào)與8號(hào)、9號(hào),試驗(yàn)組8號(hào)與9號(hào),試驗(yàn)組2號(hào)與10號(hào))差異不顯著外,其余各試驗(yàn)處理組間差異都是顯著或極顯著,說明該正交試驗(yàn)可以篩選確定出最優(yōu)組合。其中,15號(hào)試驗(yàn)處理組與其他處理間差異都為顯著或極顯著。結(jié)合極差分析和方差分析,酶用量是最為次要的影響因素。從降低成本考慮,選擇最小的酶用量,可以確定15號(hào)處理組為最優(yōu)水平組。因此確定胰蛋白酶水解豬血紅蛋白的最佳工藝參數(shù)組合為A4B3C2D4E1,即pH8.0,底物質(zhì)量濃度10g/100mL,水解時(shí)間8h,水解溫度45℃,酶用量2000U/g。

    3 結(jié) 論

    采用胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白制備降血壓肽的單因素試驗(yàn)表明胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白的水解度與水解產(chǎn)物的ACE抑制率相關(guān)性顯著,ACE抑制率隨著水解度的增減而增減。正交試驗(yàn)表明,酶用量對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響最小,各種酶解參數(shù)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響大小順序?yàn)椋簆H值>底物質(zhì)量濃度>水解時(shí)間>水解溫度>酶用量;酶用量對(duì)胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白產(chǎn)物的ACE抑制率無顯著影響;胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度10g/100mL,水解溫度45℃,pH8.0,水解時(shí)間8h,酶用量2000U/g,在此條件下水解產(chǎn)物的ACE抑制率為68.74%。

    本研究對(duì)采用胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備降血壓肽的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,在較少酶用量情況下獲得了具有較高降血壓活性的降壓肽,不僅原料便宜,而且酶用量很少。這為低成本開發(fā)降血壓肽提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]FERNANDEZ-MUSOLES R, LOPEZ-DIEZ J J, TORREGROSA G, et al. Lactoferricin B-derived peptides with inhibitory effects on ECE-dependent vasoconstriction[J]. Peptides, 2010, 31(10): 1926-1933.

    [2]陳玲, 鄒栩. 全球心血管藥物研發(fā)動(dòng)態(tài)[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2010, 19 (1): 8-16.

    [3]FERREIRA S H, ROCHA e SILVA M. Potentiation of bradykinin and eledoisin by BPF (bradykinin potentiaitng factor) from Bothrops jararaca venom[J]. Experientia, 1965, 21(6): 347-349.

    [4]MARUYAMA S, SUZUKI H A. Peptide inhibitor of angiotensin I-converting enzyme in the tryptic hydrolysates of casein[J]. Agric Biol Chem, 1982, 46(5): 1393-1394.

    [5]CHEUNG H S, WANG F L, ONDETTI M A, et al. Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence[J]. J Biol Chem, 1980, 255 (2): 401-407.

    [6]IROYUKIFUJITA H, EIICHIYOKOYAMA K, YOSHIKAWA M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins[J]. J Food Sci, 2000, 65(4): 564-569.

    [7]MIYOSHI S, ISHIKAWA H, KANEKO T, et a1. Structures and activity of angiotensin converting enzyme in soybean hydrolysates[J]. J Agric Biol Chem, 1991, 55(3): 1318-1319.

    [8]王海燕, 張佳程. 乳源ACE抑制劑(降血壓肽)的研究現(xiàn)狀[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2001, 27(11): 70-73.

    [9]MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2009, 112(1): 211-214.

    [10]MITO K, FUJII M, KUWAHARA M, et al. Antihypertensive effect of angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides derived from hemoglobin[J]. European Journal of Pharmacology, 1996, 304(1/3): 93-98.

    [11]MAN Jin, HEE J C, NAM-SOON Oh. Process development for hemeenriched peptide by enzymatic hydrolysis of hemoglobin[J]. Bioresource Technology, 2002, 84(1): 63-68.

    [12]李艷偉, 江波, 伶祥山. 酶解豬血蛋白中活性肽的純化和功能研究[J]. 高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2005, 26(1): 61-63.

    [13]ZHAO Qiuyu, SANNIER F, PIOT J M. Kinetics of appearance of four hemorphins from bovine hemoglobin peptic hydrolysates by HPLC coupled with photodiode array detection[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1295(1): 73-80.

    [14]CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1648.

    [15]黃曉鈺, 劉鄰渭. 食品化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2002: 131-132.

    Optimization of Process Parameters for Enzymatic Preparation of Antihypertensive Peptides from Porcine Hemoglobin

    LI Cheng1,GUO Qi-liang1,2,F(xiàn)U Gang1,CHEN Dai-wen1,ZOU Mo-jun1
    (1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625000, China;2. Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Chengdu 611130, China)

    In order to prepare antihypertensive peptide with high activity, trypsin was selected to hydrolyze porcine hemoglobin. The one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize hydrolysis conditions such as substrate concentration, temperature, pH, enzyme dosage and time based on the ACE inhibitory rate of hydrolyzed porcine hemoglobin. The results showed that the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis for 8 h at 45 ℃, pH 8.0, an enzyme dosage of 2000 U/g and a substrate concentration of 10 g/100 mL. Under these hydrolysis conditions, the ACE inhibitory rate of porcine hemoglobin hydrolysate was 68.74%.

    antihypertensive peptide;porcine hemoglobin;trypsin;enzymatic hydrolysis process

    TS201.2

    A

    1002-6630(2012)01-0195-05

    2011-08-08

    李誠(chéng)(1964—),男,教授,博士研究生,主要從事動(dòng)物性食品加工與質(zhì)量安全控制研究。E-mail:lichenglcp@163.com

    猜你喜歡
    降血壓物質(zhì)量抑制率
    中藥單體對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    血栓彈力圖評(píng)估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    辨證泡腳降血壓
    水庫(kù)工程區(qū)水土保持生態(tài)服務(wù)價(jià)值估算
    人民黃河(2020年12期)2020-12-30 12:55:30
    施肥量對(duì)谷子干物質(zhì)量積累及分配的影響
    不同播期與品種對(duì)糯玉米干物質(zhì)積累的影響
    降血壓八誤區(qū)
    特別健康(2018年3期)2018-07-04 00:40:12
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    飯后一根香蕉有助降血壓
    海峽姐妹(2017年12期)2018-01-31 02:12:34
    一種柱狀金屬物質(zhì)量檢測(cè)器的研究
    電子制作(2017年10期)2017-04-18 07:23:14
    极品少妇高潮喷水抽搐| 国产91av在线免费观看| 99热全是精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 熟女人妻精品中文字幕| 在线免费十八禁| 秋霞在线观看毛片| 极品教师在线视频| 国产久久久一区二区三区| 国产色爽女视频免费观看| 秋霞伦理黄片| 赤兔流量卡办理| 久久6这里有精品| 免费观看性生交大片5| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品熟女久久久久浪| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲成人一二三区av| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产在线男女| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品福利在线免费观看| 日韩中文字幕视频在线看片 | 国产人妻一区二区三区在| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品亚洲成a人片在线观看 | 一本色道久久久久久精品综合| 在线观看国产h片| 欧美性感艳星| 欧美zozozo另类| 国产中年淑女户外野战色| 如何舔出高潮| 99久久人妻综合| 亚洲第一av免费看| 伊人久久精品亚洲午夜| 岛国毛片在线播放| 亚洲色图av天堂| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产成人freesex在线| 亚洲中文av在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品一及| 色哟哟·www| 嫩草影院新地址| 午夜福利影视在线免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| 久热久热在线精品观看| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲成色77777| 这个男人来自地球电影免费观看 | 91精品国产九色| 欧美极品一区二区三区四区| 美女中出高潮动态图| 99久久精品一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美日本视频| 九九在线视频观看精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 能在线免费看毛片的网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久精品久久久久久久性| 国产大屁股一区二区在线视频| 中文字幕制服av| 观看免费一级毛片| 永久网站在线| 午夜激情久久久久久久| 97精品久久久久久久久久精品| 18+在线观看网站| 国产精品国产三级专区第一集| 国产高清国产精品国产三级 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久97久久精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 九草在线视频观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩中字成人| 美女内射精品一级片tv| 成人美女网站在线观看视频| 22中文网久久字幕| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲av免费高清在线观看| av在线app专区| 99视频精品全部免费 在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美xxⅹ黑人| 夫妻午夜视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲,欧美,日韩| 欧美日韩在线观看h| 伦理电影免费视频| 国产爽快片一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| www.色视频.com| 毛片女人毛片| 午夜免费观看性视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 天美传媒精品一区二区| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 777米奇影视久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av中文字字幕乱码综合| av在线观看视频网站免费| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 熟妇人妻不卡中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美精品国产亚洲| 美女视频免费永久观看网站| 久久人妻熟女aⅴ| 少妇的逼好多水| 久久精品国产亚洲网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 777米奇影视久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 在线精品无人区一区二区三 | 日韩视频在线欧美| 国产一区二区三区av在线| 在线观看免费高清a一片| tube8黄色片| 国产乱人视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| h日本视频在线播放| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产乱人视频| 日本av手机在线免费观看| 国产深夜福利视频在线观看| 国产永久视频网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 老女人水多毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国精品久久久久久国模美| 久久久久久人妻| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产成人精品婷婷| 美女高潮的动态| kizo精华| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲图色成人| 亚洲在久久综合| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久人人爽人人爽人人片va| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品日本国产第一区| 干丝袜人妻中文字幕| 精品一区二区三卡| 免费人成在线观看视频色| 我的老师免费观看完整版| 国内揄拍国产精品人妻在线| 嫩草影院入口| 极品少妇高潮喷水抽搐| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 在线观看一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 寂寞人妻少妇视频99o| 99久久精品热视频| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美日韩精品成人综合77777| 舔av片在线| 日韩欧美精品免费久久| 国产91av在线免费观看| 免费看不卡的av| 成人亚洲欧美一区二区av| 免费高清在线观看视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 超碰97精品在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 99久久综合免费| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产精品999| 亚洲av国产av综合av卡| 久久人人爽人人爽人人片va| 最后的刺客免费高清国语| 97在线视频观看| 下体分泌物呈黄色| 国产淫语在线视频| 身体一侧抽搐| 99热国产这里只有精品6| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本vs欧美在线观看视频 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 中文天堂在线官网| av一本久久久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 99久久人妻综合| 波野结衣二区三区在线| 免费观看a级毛片全部| 成人漫画全彩无遮挡| 97精品久久久久久久久久精品| 午夜视频国产福利| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产色婷婷99| 制服丝袜香蕉在线| 色吧在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| av黄色大香蕉| 亚洲成人av在线免费| 99久久精品热视频| 丰满少妇做爰视频| 亚洲第一av免费看| 中文字幕av成人在线电影| 在线观看国产h片| 久久精品国产亚洲网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日本wwww免费看| 一级黄片播放器| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 成年女人在线观看亚洲视频| 七月丁香在线播放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| av卡一久久| 赤兔流量卡办理| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品一二三区在线看| 大陆偷拍与自拍| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日日啪夜夜爽| 国产黄频视频在线观看| 99久国产av精品国产电影| 国产成人一区二区在线| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av在线观看美女高潮| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲综合精品二区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久精品94久久精品| 成年女人在线观看亚洲视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产视频内射| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产亚洲精品久久久com| 岛国毛片在线播放| 国产黄片视频在线免费观看| kizo精华| 国产亚洲欧美精品永久| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产视频内射| 国产爱豆传媒在线观看| 成年人午夜在线观看视频| .国产精品久久| 综合色丁香网| 午夜免费男女啪啪视频观看| 多毛熟女@视频| 国产色爽女视频免费观看| 在线观看一区二区三区| 如何舔出高潮| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久国产网址| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| a级毛色黄片| 永久免费av网站大全| 一级毛片我不卡| 国产成人精品福利久久| 超碰av人人做人人爽久久| 精品一品国产午夜福利视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 美女国产视频在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 国产极品天堂在线| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品久久久久久av不卡| h日本视频在线播放| 久久久久久久精品精品| 99re6热这里在线精品视频| 国产亚洲最大av| tube8黄色片| 久久99热这里只有精品18| 极品教师在线视频| 精品久久久久久久久亚洲| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲精品成人av观看孕妇| kizo精华| 亚洲无线观看免费| 亚洲欧美精品专区久久| 最近手机中文字幕大全| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 成人免费观看视频高清| 欧美另类一区| 老熟女久久久| 日本av免费视频播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品.久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中国三级夫妇交换| 欧美精品亚洲一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 日韩欧美 国产精品| 久久久久久久精品精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产免费视频播放在线视频| 美女中出高潮动态图| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲综合精品二区| 97超碰精品成人国产| 成人国产麻豆网| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲国产精品专区欧美| 免费黄色在线免费观看| 国产成人freesex在线| 中文字幕免费在线视频6| 人妻一区二区av| 视频区图区小说| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产91av在线免费观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美国产精品一级二级三级 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一级毛片我不卡| a级一级毛片免费在线观看| 三级经典国产精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 九色成人免费人妻av| 51国产日韩欧美| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲成人手机| 国产淫语在线视频| 观看av在线不卡| 色婷婷久久久亚洲欧美| www.av在线官网国产| 久久久国产一区二区| 欧美成人午夜免费资源| 交换朋友夫妻互换小说| 久久韩国三级中文字幕| kizo精华| 久久久久视频综合| 成人二区视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人免费无遮挡视频| 久久这里有精品视频免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品一二三区在线看| 国产免费福利视频在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 欧美日本视频| 各种免费的搞黄视频| 中文在线观看免费www的网站| 日本vs欧美在线观看视频 | 日本免费在线观看一区| 久久久色成人| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲人与动物交配视频| 黄片无遮挡物在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 一区二区av电影网| 99热这里只有是精品50| 多毛熟女@视频| 国产精品人妻久久久久久| 久久久久人妻精品一区果冻| 人妻一区二区av| 久久99热这里只频精品6学生| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一级毛片我不卡| 看十八女毛片水多多多| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久久久久久久丰满| 永久网站在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 欧美精品一区二区免费开放| 18禁在线播放成人免费| 特大巨黑吊av在线直播| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品一区二区三卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 在线观看国产h片| 久久久久久久久久久丰满| 久久久久久伊人网av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久精品94久久精品| 欧美+日韩+精品| 嫩草影院新地址| 一个人看的www免费观看视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 高清欧美精品videossex| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品偷伦视频观看了| 中文字幕亚洲精品专区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文字幕久久专区| 欧美性感艳星| 三级经典国产精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲真实伦在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 视频区图区小说| 丝袜喷水一区| 国产男女内射视频| 在线精品无人区一区二区三 | 久久人妻熟女aⅴ| 水蜜桃什么品种好| 日本午夜av视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片 | 国产免费视频播放在线视频| 天堂中文最新版在线下载| 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清黄色对白视频在线免费看 | 久热这里只有精品99| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲经典国产精华液单| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩在线高清观看一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 日本免费在线观看一区| 一级黄片播放器| 美女主播在线视频| 亚洲人成网站高清观看| 中国国产av一级| 亚洲中文av在线| 免费观看的影片在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 在线观看国产h片| 成人综合一区亚洲| 高清日韩中文字幕在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产真实伦视频高清在线观看| 51国产日韩欧美| 欧美精品一区二区大全| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费观看av网站的网址| 能在线免费看毛片的网站| 免费av不卡在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产探花极品一区二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 啦啦啦在线观看免费高清www| 老女人水多毛片| 国产成人免费观看mmmm| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一区在线观看完整版| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜日本视频在线| 亚洲图色成人| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲精品国产av蜜桃| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品99久久久久久久久| videossex国产| 亚洲精品aⅴ在线观看| 婷婷色av中文字幕| 亚州av有码| 在线播放无遮挡| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美精品一区二区大全| 中文字幕制服av| 亚洲av福利一区| av专区在线播放| 青春草亚洲视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 免费少妇av软件| xxx大片免费视频| 一级爰片在线观看| 免费观看a级毛片全部| 久久久久精品性色| 久久久久久久久久久免费av| 丰满乱子伦码专区| 最近最新中文字幕大全电影3| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品一区www在线观看| 欧美区成人在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲av日韩在线播放| 嫩草影院入口| 一个人看的www免费观看视频| 毛片一级片免费看久久久久| 波野结衣二区三区在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 免费观看无遮挡的男女| 国产精品.久久久| 久久午夜福利片| 高清午夜精品一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜福利高清视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 2022亚洲国产成人精品| 99热这里只有是精品在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产爽快片一区二区三区| 99久久精品热视频| 少妇精品久久久久久久| 少妇的逼好多水| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产亚洲最大av| 亚洲久久久国产精品| 国产免费视频播放在线视频| 最近中文字幕2019免费版| 久久久色成人| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 美女高潮的动态| 亚洲真实伦在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 一级二级三级毛片免费看| 精品熟女少妇av免费看| a 毛片基地| 国产精品福利在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 青春草视频在线免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 妹子高潮喷水视频| 国产黄色免费在线视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 交换朋友夫妻互换小说| av女优亚洲男人天堂| 国产成人精品久久久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲自偷自拍三级| 精品久久久噜噜| 亚洲国产欧美在线一区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 丰满乱子伦码专区| 亚洲性久久影院| 美女福利国产在线 | 久久久国产一区二区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 黄色怎么调成土黄色| 免费av不卡在线播放| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品视频女| 国产精品久久久久久精品古装| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 韩国av在线不卡| 3wmmmm亚洲av在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美日本视频| 久久韩国三级中文字幕| 寂寞人妻少妇视频99o| 麻豆乱淫一区二区| 在线观看一区二区三区| 国产高清三级在线| 国产精品一区二区在线不卡| 成人免费观看视频高清| 老司机影院成人| av播播在线观看一区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品久久久久久久久av| 日本黄色日本黄色录像| 免费观看的影片在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 蜜臀久久99精品久久宅男| 一级爰片在线观看| 天天躁日日操中文字幕| av播播在线观看一区| 99久久精品一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲美女搞黄在线观看|