廣林9號(hào)桉葉多酚抗氧化活性研究

王俊亮，肖蘇堯，陳運(yùn)嬌，陳雪香，湯 杰，曹 庸

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

廣林9號(hào)桉葉多酚抗氧化活性研究

王俊亮，肖蘇堯，陳運(yùn)嬌，陳雪香，湯 杰，曹 庸*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

采用不同極性有機(jī)溶劑對(duì)廣林9號(hào)桉葉提取物進(jìn)行系統(tǒng)萃取分離，用福林-酚法測(cè)定各組分的總酚含量，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2＇-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、還原能力3種體外抗氧化活性方法測(cè)定了桉葉各組分的抗氧化活性。結(jié)果表明，不同萃取組分中，乙酸乙酯組分總酚含量最高，達(dá)到502.67mg/g；其對(duì)DPPH自由基和ABTS＋·的清除能力和還原能力也最強(qiáng)，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物茶多酚，其清除兩種自由基的IC50分別為0.097mg/mL 和0.034mg/mL；通過(guò)總酚含量與抗氧化活性比較發(fā)現(xiàn)，其抗氧化活性與總酚含量成正相關(guān)，由此判斷桉葉提取物的抗氧化活性成分主要為多酚類物質(zhì)；桉葉粗提物中多酚含量達(dá)到30%以上，與茶葉粗提物中多酚含量相當(dāng)，具有開發(fā)意義。

桉葉；多酚；抗氧化能力；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；2,2＇-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)

桉樹是桃金娘科桉屬(Eucalyptus)植物的通稱，具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)自然環(huán)境能力強(qiáng)、抗病蟲害、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，是世界三大速生樹種之一[1-2]。我國(guó)近年來(lái)在華南、廣西等地大面積種植桉樹，桉樹已經(jīng)成為中國(guó)造紙業(yè)和林業(yè)中的生力軍，而同時(shí)產(chǎn)生大量桉葉，桉葉除部分用于提取桉葉油以外，多數(shù)未加利用，綜合利用度很低?，F(xiàn)代研究表明，桉葉中除含有揮發(fā)性芳香油以外，還含有大量黃酮類化合物、?；g苯三酚衍生物、非揮發(fā)性萜類及其苷類、鞣質(zhì)等活性物質(zhì)[3]，因此系統(tǒng)地對(duì)桉葉中活性物質(zhì)進(jìn)行研究，并加以開發(fā)應(yīng)用，可以極大地提高桉樹的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。有研究表明，已從藍(lán)桉中分離出抗氧化活性較強(qiáng)的多種多酚物質(zhì)[4-6]，本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明，桉葉粗提物多酚含量達(dá)到30%左右，與茶葉粗提物多酚含量相當(dāng)，且抗氧化活性強(qiáng)[7]。因此本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)桉葉粗提物進(jìn)行系統(tǒng)的分離，利用福林-酚比色法[8-9]對(duì)多酚含量進(jìn)行分析，并通過(guò)抗氧化活性檢測(cè)進(jìn)行活性跟蹤。

目前，天然產(chǎn)物的抗氧化能力檢測(cè)方法主要有化學(xué)測(cè)定法和細(xì)胞評(píng)價(jià)方法，其中化學(xué)測(cè)定方法有以脂質(zhì)過(guò)氧化為基礎(chǔ)的測(cè)定方法、清除自由基為基礎(chǔ)的測(cè)定方法、對(duì)抗氧化酶活性的影響、DNA氧化損傷的測(cè)定等方法，由于天然抗氧化物種成分復(fù)雜，抗氧化作用機(jī)制無(wú)法用單一機(jī)制解釋，因此常常需要用兩種或兩種以上抗氧化活性評(píng)價(jià)方法[10]。對(duì)于天然抗氧化劑的初步篩選，基于清除自由基基礎(chǔ)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2,2＇-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)法與其他抗氧化方法相比操作簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定，不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，這兩種方法都是基于分光光度法來(lái)測(cè)定樣品的抗氧化活性，在國(guó)內(nèi)外有著廣泛的應(yīng)用。而鐵離子還原能力可以間接表明樣品抗氧化能力，操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)主要采用DPPH法、ABTS法和鐵離子還原能力法對(duì)桉葉不同萃取組分進(jìn)行體外抗氧化活性檢測(cè)，以期為桉葉抗氧化活性物的篩選及綜合開發(fā)桉樹葉資源提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣林9號(hào)桉葉，2009年9月采于湛江，自然晾干，粉碎后取40～60目進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、VC、過(guò)硫酸鉀、福林-酚試劑、三氯乙酸、鐵氰化鉀、Na2CO3、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純；50%多酚含量的茶多酚 潮州翼龍有限公司；DPPH、ABTS美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3010紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；R204旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司； KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司； FD-1PF冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司、MK-3酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo Labsystems 公司。

1.3 方法

1.3.1 桉葉成分的提取分離

桉葉粗提物的制備[7]：稱取桉葉粉末100.0g，加入20倍體積的70%乙醇溶劑，超聲波提取兩次，每次30min，減壓抽濾，合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后，用蒸餾水定容到100mL。

粗提物的系統(tǒng)萃取分離：對(duì)上述粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等不同極性溶劑進(jìn)行萃取，萃取物用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，冷藏備用。

1.3.2 多酚含量的測(cè)定(福林-酚比色法)[8-9]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取真空干燥至質(zhì)量恒定的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品44.3mg，用水溶解并定容100mL。以此溶液配成質(zhì)量濃度8.86、17.72、35.44、52.16、70.88、88.60μg/mL的溶液。分別取上述不同質(zhì)量濃度溶液1mL加到10mL比色管中，然后依次加入1mL去離子水，0.5mL已稀釋2倍的福林-酚試劑，1.5mL 26.7g/100mL的Na2CO3溶液，最后用水定容至10mL，室溫反應(yīng)2h，用分光光度計(jì)測(cè)定其在760nm波長(zhǎng)處的吸光度。由吸光度對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試樣測(cè)定：準(zhǔn)確稱取適量試樣，用水溶解，質(zhì)量濃度在0.1mg/mL左右。取1mL樣品加到10mL比色管中，依次加入去離子水1mL、福林-酚試劑0.5mL、26.7g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，然后用水定容至10mL，室溫反應(yīng)2h，用分光光度計(jì)測(cè)定其在760nm波長(zhǎng)處的吸光度。測(cè)定的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得試樣中總多酚的含量，以沒食子酸含量計(jì)。

1.3.3 清除DPPH自由基能力的測(cè)定[10-11]

分別將各相萃取物用甲醇配成0.02、0.05、0.08、0.11、0.14、0.17、0.20mg/mL系列梯度樣品質(zhì)量濃度，取上述配好樣品0.2mL 及1 × 10-4mol/L DPPH溶液3.8mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫密閉靜置30min，用純?nèi)軇┳鲄⒈?，用分光光度?jì)測(cè)定其在517nm波長(zhǎng)處的吸光度。根據(jù)公式(1)計(jì)算每種樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：As為加0.2mL樣品液后DPPH溶液的吸光度；Asb為0.2mL樣品液＋3.8mL溶劑(甲醇)后的吸光度； Ac為0.2mL溶劑(甲醇)＋3.8mL DPPH溶液的吸光度。

以上述方法測(cè)定其清除率，根據(jù)回歸分析求出清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度即IC50。

1.3.4 清除ABTS＋·能力測(cè)定[12-14]

將5mL的7mmol/L ABTS和88μL的140mmol/L過(guò)硫酸鉀混合，在室溫、避光的條件下靜置過(guò)夜(12～16h)，形成ABTS儲(chǔ)備液，使用前用10mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋成工作液，使其在室溫下于條件734nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.02。分別將各相萃取物用甲醇配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg/mL系列梯度樣品質(zhì)量濃度，測(cè)定時(shí)在96孔微量滴定板的每孔中加入200μL的ABTS工作液，再加入10μL的樣品，以200μL ABTS工作液＋10μL溶劑為空白，混合10s，于6min后讀取405nm波長(zhǎng)處的吸光度A，根據(jù)式(2)計(jì)算每種樣品對(duì)ABTS＋·的清除率。

式中：A1為200μL ABTS工作液＋10μL樣品液后的吸光度；A0為200μL ABTS工作液＋10μL甲醇后的吸光度。

1.3.5 還原能力測(cè)定[15-16]

在2.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液中加入用甲醇配成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg/mL系列梯度質(zhì)量濃度的不同桉葉萃取物樣液2.5mL、1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合物在50℃恒溫20min后，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液5mL加蒸餾水5mL和0.1% FeCl3溶液lmL，在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉葉不同萃取物總酚含量測(cè)定結(jié)果

以沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y＝0.0096χ＋0.0271(R2＝0.9981)。樣品中總酚的含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的值，總酚含量以沒食子酸的相對(duì)量表示。

從表1可見，桉葉提取物不同溶劑萃取物中，乙酸乙酯總酚含量最大，其次為正丁醇、水相，而石油醚相、氯仿相總酚含量較小，不同溶劑系統(tǒng)萃取分離對(duì)桉葉多酚能夠起到一定的分離效果，從桉葉粗提取物多酚含量可以看出，其多酚含量達(dá)到30%以上，與茶葉粗提物中茶多酚含量相當(dāng)，桉葉原料豐富，因此大量開發(fā)桉葉多酚將具有十分重要意義。

2.2 桉葉不同萃取物清除DPPH自由基能力

圖1 桉葉不同萃取物清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH radical scavenging activity of the crude ethanol extract and its fractions

如圖1所示，同一樣品隨著樣品質(zhì)量濃度增大，其清除DPPH自由基能力逐漸增大，且VC質(zhì)量濃度在達(dá)到0.11mg/mL后，其清除率趨于平緩，達(dá)到最大。而乙酸乙酯萃取物在質(zhì)量濃度達(dá)到0.17mg/mL時(shí)，其清除率接近VC，且達(dá)到最大。由此可見，桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，且清除能力大于茶多酚，與VC接近。通過(guò)SPSS軟件回歸分析，得出其IC50為0.097mg/mL，可信區(qū)間為0.077～0.111mg/mL。

2.3 桉葉不同萃取物清除ABTS＋·能力

圖2 桉葉不同萃取物清除ABTS＋·能力Fig.2 ABTS radical scavenging activity of the crude ethanol extract and its fractions

如圖2所示，同一樣品隨著樣品質(zhì)量濃度增大，其清除ABTS＋·能力逐漸增大，而乙酸乙酯萃取物在質(zhì)量濃度達(dá)到0.05mg/mL時(shí)，其清除率趨于平緩，且達(dá)到最大值。桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物清除ABTS＋·能力最強(qiáng)，且清除能力大于茶多酚和VC。通過(guò)SPSS軟件回歸分析，得出其IC50為0.034mg/mL，95%可信區(qū)間為0.029～0.037mg/mL。

2.4 桉葉不同萃取物還原能力

圖3 桉葉不同萃取物對(duì)鐵離子的還原能力曲線Fig.3 Ferric ion reducing power of the crude ethanol extract and its fractions

表1 桉葉不同萃取物總酚含量Table1 Total phenloic contents of the crude ethanol extract and its fractions

表2 桉葉不同萃取物對(duì)DPPH自由基、ABTS＋·的IC50值Table2 IC50values of the crude ethanol extract and its fractions against DPPH and ABTS radicals

由圖3可知，同一樣品隨著樣品質(zhì)量濃度越大，其吸光度越大，即還原能力越強(qiáng)，且VC在質(zhì)量濃度達(dá)到0.08mg/mL后，其吸光度趨于平緩，即還原能力達(dá)到最大；桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物還原能力最強(qiáng)，其還原能力大于茶多酚，最接近VC；VC在反應(yīng)體系中吸光度較大，可能是VC在此體系中較易提供電子。

2.5 桉葉不同萃取物清除DPPH自由基、ABTS＋·能力比較

桉葉萃取物不同質(zhì)量濃度條件下對(duì)DPPH自由基體系，ABTS＋·體系的清除作用有所不同，同一萃取物在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品質(zhì)量濃度越高，其清除率越高，抗氧化活性越強(qiáng)。通過(guò)SPSS軟件算出桉葉不同萃取物對(duì)兩種自由基清除能力的值見表2。桉葉不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基和ABTS＋·的IC50最小，即抗氧化活性最強(qiáng)；由于反應(yīng)體系不同，其對(duì)兩種自由基清除能力也有所不同，但兩種方法具有很好的相關(guān)性。桉葉石油醚萃取物和氯仿萃取物清除DPPH自由基和ABTS＋·的IC50的95%可信區(qū)間較大，可能是因?yàn)檫@兩個(gè)組分在所做樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除率較小，所求IC50誤差就較大，95%可信區(qū)間大。

2.6 桉葉不同萃取物多酚含量與其抗氧化能力分析

為比較桉葉不同萃取物抗氧化能力與其總酚含量關(guān)系，以桉葉不同萃取物清除DPPH自由基和ABTS＋·的IC50的倒數(shù)與其總酚含量為縱坐標(biāo)作圖，IC50倒數(shù)值越大，其抗氧化能力越強(qiáng)?？寡趸芰εc其多酚含量關(guān)系見圖4?？偡雍吭蕉?，抗氧化能力越強(qiáng)，其抗氧化能力與其總酚含量成正相關(guān)，因此可以判斷桉葉中起抗氧化作用的物質(zhì)為多酚類物質(zhì)。且桉葉不同萃取物抗氧化能力強(qiáng)弱為：乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞水萃取物＞石油醚萃取物＞氯仿萃取物。抗氧化強(qiáng)的組分主要存在于中等極性和極性大的組分中，這也與多酚的性質(zhì)相關(guān)。石油醚萃取物主要是極性小的脂溶性物質(zhì)，氯仿萃取物主要是糖類和蛋白，多酚含量少，因此抗氧化活性也低。

圖4 桉葉不同萃取組分抗氧化活性與其總酚含量關(guān)系Fig.4 Positive correlation between total phenolic content and antioxidant activity for the crude ethanol extract and its fractions

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合總酚含量和抗氧化活性評(píng)價(jià)對(duì)桉葉抗氧化物進(jìn)行系統(tǒng)研究，研究表明桉葉中含有大量多酚，粗提取物中多酚含量達(dá)到30%以上，與茶葉粗提取物中多酚含量相當(dāng)，通過(guò)體外抗氧化活性測(cè)定表明，其抗氧化活性與其總酚含量成正相關(guān)，初步的系統(tǒng)萃取分離對(duì)桉葉抗氧化物有較好的分離效果，且得到總酚含量最高，抗氧化活性最強(qiáng)的乙酸乙酯組分，其抗氧化活性較50%多酚含量的茶多酚強(qiáng)，與VC接近，因此桉葉多酚具有很高的開發(fā)價(jià)值；DPPH法、ABTS法和鐵離子還原法對(duì)桉葉抗氧化物體外抗氧化活性評(píng)價(jià)有較好的相關(guān)性，3種方法在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)都隨樣品質(zhì)量濃度增大，抗氧化活性增強(qiáng)，DPPH法、ABTS法對(duì)于桉葉抗氧化活性的評(píng)價(jià)快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，因此可以將其作為桉葉抗氧化物活性評(píng)價(jià)及抗氧化活性物質(zhì)篩選的評(píng)價(jià)方法。

桉葉資源豐富、總酚含量高、抗氧化活性強(qiáng)，如果能用DPPH法、ABTS法這兩種活性評(píng)價(jià)方法對(duì)桉葉乙酸乙酯組分進(jìn)行活性跟蹤分離純化，分離出其抗氧化活性物質(zhì)，確定其起抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，開發(fā)食品抗氧化劑或者抗氧化保健品，對(duì)于桉葉的綜合利用將具有十分重要的意義。

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Antioxidant Activity of Polyphenol Extracts from Leaves of E. grandis×E. urophylla Guanglin No. 9

WANG Jun-liang，XIAO Su-yao，CHEN Yun-jiao，CHEN Xue-xiang，TANG Jie，CAO Yong*
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Crude ethanol extract from the leaves of E. grandis×E. urophylla Guanglin No. 9 was fractionated by repeated extractions sequentially with solvents of different polarity into petroleum ether-soluble, chloroform-soluble, ethyl acetatesoluble, n-butanol-soluble fractions and residue. Total phenolic contents in the six samples were determined by Folin-Ciocalteu method. Meanwhile, their antioxidant activity was tested by in vitro ABTS, DPPH and FRAP assays. The results indicated that among the samples, the ethyl acetate-soluble fraction showed the highest total phenolic content, 502.67 mg/g, and the strongest ABTS and DPPH scavenging activity and reducing power activity, which were better than those of VC. The IC50 values of the fraction against DPPH and ABTS radicals were 0.097 mg/mL and 0.034 mg/mL, respectively. Moreover, a positive correlation between total phenolic content and antioxidant activity was observed for all the samples. This indicates that polypehnolics are mainly responsible for their antioxidant activity. The crude ethanol extract exhibited a total phenloic content (over 30%) similar to that of its counterpart from tea. This study demonstrates that the crude ethanol extract has a high exploitation potential.

eucalyptus leaf；polyphenol；antioxidant activity；DPPH；ABTS

Q946

A

1002-6630(2012)01-0020-05

2011-02-18

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201104003-03)

王俊亮(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。E-mail：wjl3333@163.com

*通信作者：曹庸(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與功能性食品開發(fā)。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn