固定化酶技術(shù)在茶葉方面的研究與應(yīng)用

段 瑩 張靈枝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶業(yè)茶學(xué)系 廣州 510642)

固定化酶是用物理或化學(xué)方法處理水溶性的酶使之變成不溶于水或固定于固相載體的但仍具有酶活性的酶衍生物［1］。作為酶學(xué)研究的新領(lǐng)域，固定化酶因其顯著的優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到重視，通過(guò)將這項(xiàng)生物技術(shù)與茶葉生產(chǎn)相結(jié)合，有利于充分發(fā)揮茶葉內(nèi)含酶在茶葉生產(chǎn)與深加工方面的重要作用，改善茶葉品質(zhì)，拓展茶葉的深加工領(lǐng)域和應(yīng)用范圍。

1 固定化酶技術(shù)的發(fā)展

固定化酶現(xiàn)象最早在1916年被 Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)，而直到1969年千煙一郎博士將其應(yīng)用于工業(yè)，固定化酶才得以迅猛發(fā)展［2，3］。得益于固定化酶的穩(wěn)定性高、易于控制、回收方便、可反復(fù)使用、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，酶的固定化技術(shù)已經(jīng)成為酶應(yīng)用領(lǐng)域中的一個(gè)重要研究方向，推動(dòng)生物酶得到廣泛而有效的利用，并開(kāi)始在食品行業(yè)、生物工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷與藥品研究、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)以及基礎(chǔ)研究等方面發(fā)揮重要作用［4］。

傳統(tǒng)的酶固定化方法大致可分為4類(lèi):吸附法［5］、交聯(lián)法［6］、包埋法［7］、共價(jià)結(jié)合法［8］。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的交叉發(fā)展，單一傳統(tǒng)固定化方法暴露的缺點(diǎn)已明顯限制了固定化酶技術(shù)的應(yīng)用。因此在實(shí)際應(yīng)用中，定向固定化酶技術(shù)以及多酶共固開(kāi)始使用，嘗試多種方法交叉使用，以提高固定化酶的活力，取長(zhǎng)補(bǔ)短。Zuzana等［9］通過(guò)使用高碘酸鈉活化半乳糖氧化酶糖鏈實(shí)現(xiàn)了對(duì)半乳糖氧化酶的定向固定，改善了催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)。蘇二正等人［10］比較了海藻酸鈉和殼聚糖兩種載體及不同固定化方法對(duì)單寧酶和β-葡萄糖苷酶的共固定化效果，結(jié)果表明以海藻酸鈉為載體，采用交聯(lián)-包埋-交聯(lián)固定化方法的效果最佳。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，以降低成本，提高酶活性和穩(wěn)定性，盡量減少或避免酶活力的損失為前提，新型載體酶固定化與無(wú)載體酶固定化技術(shù)開(kāi)始受到廣泛關(guān)注，并開(kāi)展了大量研究。Kong等［11］以由海洋細(xì)菌Zoogloeasp.產(chǎn)生的細(xì)胞結(jié)合多糖(CBP)凝膠珠為載體固定葡糖淀粉酶。Serrano等［12］研究一類(lèi)新型的無(wú)載體酶固定化技術(shù)——交聯(lián)酶聚集體(CLEA)，將其用于氨基?；傅墓潭ɑ?，預(yù)期會(huì)顯著提高酶活回收率，降低成本。

2 固定化酶技術(shù)在茶葉方面的研究

固定化酶技術(shù)在茶葉方面的應(yīng)用起步較晚，始于20世紀(jì)60年代，最早應(yīng)用于解決紅茶“冷后渾”的問(wèn)題。一項(xiàng)英國(guó)專(zhuān)利使用硅藻土固定單寧酶可以有效處理紅茶“冷后渾”的問(wèn)題［13－15］。而日本則是將單寧酶固定在聚砜中空纖維超濾膜上以此獲得澄凈的茶湯［16］。

其后的研究主要集中在茶葉重要酶類(lèi)的固定化方面，包括多酚氧化酶、β-葡萄糖苷酶、過(guò)氧化物酶、單寧酶、果膠酶等。通過(guò)對(duì)茶葉重要酶類(lèi)酶固定化方法的研究與探討，尋求固定化技術(shù)的最優(yōu)條件和最佳組合，從而實(shí)現(xiàn)酶的最大利用率，在茶葉深加工方向和檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

3 定化酶技術(shù)在茶葉方面的應(yīng)用

3.1 茶飲料改進(jìn)

速溶茶和茶飲料因其方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，在近幾年內(nèi)飛速發(fā)展并成為茶葉深加工的重要方向。但其冷溶性差、香氣淡薄、易產(chǎn)生混濁、風(fēng)味保存期短等問(wèn)題一直難以得到有效解決，嚴(yán)重阻礙了茶飲料行業(yè)的發(fā)展。

針對(duì)這些問(wèn)題，前人開(kāi)展了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)單寧酶可以提高轉(zhuǎn)溶率，去除混濁現(xiàn)象;果膠酶能提高萃取率，改善茶湯的清澈度。此外，纖維素酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、多酚氧化酶及過(guò)氧化物酶等對(duì)茶飲料品質(zhì)也具有良好的改善作用。

呂連梅［17］研究發(fā)現(xiàn)，在茶飲料生產(chǎn)中添加固定化酶能有效改善茶飲料包括香氣在內(nèi)的品質(zhì)，茶湯添加果膠酶的處理有效的改善了茶湯的感官風(fēng)味:香氣較高，滋味醇和。此外，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，果膠含量、茶湯的pH值降低，有可能延長(zhǎng)保存期。

李平等［18］將固定化β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于茶飲料的增香，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析后發(fā)現(xiàn)香氣的種類(lèi)和總量均有所增加。蘇二正［19］將單寧酶與β-葡萄糖苷酶共固定化應(yīng)用于茶飲料的除混研究，試驗(yàn)顯示，經(jīng)共固定化酶處理后茶飲料中的酯型兒茶素有所降解，茶飲料的濁度非常穩(wěn)定，茶乳酪的形成減少。

3.2 茶葉天然產(chǎn)物的生產(chǎn)

3.2.1 茶黃素生產(chǎn) 現(xiàn)代研究已經(jīng)表明茶黃素具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗心腦血管疾病等多種功效且效果明顯優(yōu)于茶多酚，被廣泛認(rèn)定為茶葉生化成分利用潛力最大的物質(zhì)之一。但是，從紅茶中提取得率低、分離純化困難、成本高，難于實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。因此，獲取高含量的茶黃素已成為茶學(xué)、食品和醫(yī)藥研究的重要課題。

屠幼英等［20］探討了固定化多酚氧化酶酶膜催化兒茶素生產(chǎn)茶黃素的最佳反應(yīng)條件，并確定了酶膜法生產(chǎn)高純度茶黃素的5個(gè)重要因素及最佳組合，試驗(yàn)獲得茶黃素含量75.0%以上的高純度茶黃素產(chǎn)品。

丁兆堂［21］用納米碳酸鈣固定多酚氧化酶，對(duì)茶多酚進(jìn)行體外氧化制備茶黃素，結(jié)果表明，此法提取物含量較高、活性良好，具有工藝簡(jiǎn)單、易于分離等優(yōu)點(diǎn)。陳曉敏［22］通過(guò)對(duì)比海藻酸鈉和殼聚糖2種固定化材料，確定固定化酶的最佳參數(shù)為酶液與海藻酸鈉比率1∶1、戊二醛濃度0.25%、cac12濃度2.0%，在pH在2.2～5.6的范圍內(nèi)茶黃素穩(wěn)定性較高。

3.2.2 茶氨酸生產(chǎn) Varuzhan H.Abelian等將Pseudomonas nitroreducens進(jìn)行固定化，利用微生物酶連續(xù)將谷氨酰胺和乙胺轉(zhuǎn)化成茶氨酸，并認(rèn)為溫度、pH、底物流速是影響茶氨酸合成效率的關(guān)鍵因素。

一項(xiàng)南京工業(yè)大學(xué)專(zhuān)利利用介孔TiO2材料多孔的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，固定化γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶為催化劑(MTOW-GGT)，一步法合成L-茶氨酸。其固定化酶是常規(guī)有機(jī)載體Eupergit C擔(dān)載量的30倍。

3.3 農(nóng)殘檢測(cè)測(cè)定

酶抑制法作為農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的重要手段，其檢測(cè)用酶最為關(guān)鍵。植物酯酶因其來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，成為酶抑制劑法測(cè)定農(nóng)藥殘留的主要來(lái)源。但是其保存條件非?？量蹋话阋４嬖冢?0℃，在0℃左右大部分已失活，使用受到一定的限制;通過(guò)酶固定化后可以有效改善不易保存的弊端，對(duì)農(nóng)藥的抑制效果也更加靈敏，便于保存與操作［23］。

許娟等［24］進(jìn)行了硝酸纖維素膜(NC)固定植物酯酶的研究，建立了NC膜固定化植物酯酶的方法。與游離酶檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，固定化酶對(duì)所測(cè)農(nóng)藥敏感性都較高，更適合于農(nóng)藥的快速檢測(cè)。此外，一項(xiàng)農(nóng)藥殘留快速測(cè)定的國(guó)際專(zhuān)利將乙酰膽堿酯固定在一種特殊的、不與其活性部位發(fā)生反應(yīng)的載體上面，既提高酶的穩(wěn)定性，又排除雜質(zhì)對(duì)酶活性的影響，提高靈敏度100倍以上，方便儲(chǔ)存和保藏［25］。

3.4 酶?jìng)鞲衅?/h3>

酶生物傳感器是由固定化的生物敏感膜和與之密切結(jié)合的換能系統(tǒng)組成，它把固化酶和電化學(xué)傳感器結(jié)合在一起，兼具了固定化酶專(zhuān)一性、高選擇性以及電化學(xué)高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。在生物傳感器領(lǐng)域中占有非常重要的地位?，F(xiàn)階段，通過(guò)酶固定化技術(shù)將酶膜與電、光、熱等敏感的元件組成酶?jìng)鞲衅饔糜诓枞~內(nèi)含成分的檢測(cè)已有較多研究。

Chindilous［26］研究了茶葉中酚類(lèi)物質(zhì)定量的酶膜傳感器制作方法，并將連接光導(dǎo)纖維的柱型酶?jìng)鞲衅饔糜诓枞~黃烷醇類(lèi)的定量。日本學(xué)者堀江秀樹(shù)［27］在氧電極頂部透氧性聚匹氟乙烯膜表面用丙烯樹(shù)脂網(wǎng)固定L-氨基酸氧化酶，制成酶?jìng)鞲衅?，測(cè)定茶葉浸出液中的氨基酸濃度。此法對(duì)于高檔茶葉中含量較多的茶氨酸和精氨酸響應(yīng)較強(qiáng)，適合在茶葉品質(zhì)評(píng)定上應(yīng)用。

5 小結(jié)

酶具有反應(yīng)條件溫和，專(zhuān)一性強(qiáng)、反應(yīng)效率高等特點(diǎn)，在茶葉深加工中有很大的應(yīng)用。但是，目前的研究表明，通過(guò)酶的利用并沒(méi)有徹底解決茶加工中存在的問(wèn)題，如香氣喪失、渾濁沉淀等。同時(shí)，酶本身在催化過(guò)程中易喪失，回收率很低，生產(chǎn)成本大。這些都阻礙了茶葉研究中酶的有效利用。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展以及酶工程自身的完善，酶工程與茶葉深加工結(jié)合得更加緊密。固定化酶技術(shù)作為酶學(xué)研究的新領(lǐng)域，其顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在茶葉的深加工方向及應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。在茶葉生產(chǎn)中運(yùn)用固定化酶技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)制茶工藝進(jìn)行改善，可以有效解決茶葉深加工中提取率不高、茶湯易混濁等問(wèn)題，提升提取效率，增加生產(chǎn)效益。在解決茶葉品質(zhì)問(wèn)題、開(kāi)發(fā)茶葉新產(chǎn)品方面達(dá)到事半功倍的效果。

但在目前的固定化酶應(yīng)用中，依然存在酶活不高，操作半衰期不夠長(zhǎng)，成本過(guò)高，不符合大工業(yè)生產(chǎn)的要求等問(wèn)題。有理由相信，隨著對(duì)酶學(xué)研究的深入，酶固定化研究將會(huì)取得新的進(jìn)展和突破。固定化技術(shù)為酶的研究和應(yīng)用提供了廣闊的前景，同時(shí)，也為茶葉行業(yè)開(kāi)辟了新的發(fā)展空間，注入新的活力［28］。

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