E-鈣粘蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

陳宇 杜勇 李浩渤 張英懷

E-鈣粘蛋白編碼基因定位于16號(hào)染色體q22.1附近，是介導(dǎo)上皮細(xì)胞間粘連的一種細(xì)胞粘附分子，對(duì)Ca2+有高度敏感性。在生理?xiàng)l件下E-鈣粘蛋白對(duì)維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及參與維持細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附力都具有重要作用［1］。目前研究認(rèn)為E-鈣粘蛋白是一種抑癌基因，當(dāng)其在腫瘤組織中活性正常時(shí)，腫瘤細(xì)胞不易從原發(fā)灶上脫落，E-cad通過(guò)加強(qiáng)細(xì)胞間的黏附力及抑制細(xì)胞增殖來(lái)發(fā)揮抑癌功能;而其活性降低或失活時(shí)則導(dǎo)致細(xì)胞黏附功能下降從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。研究表明腫瘤組織中E-鈣粘蛋白的表達(dá)下降與腫瘤的分化程度、發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)［2］。本研究通過(guò)免疫組化的試驗(yàn)方法檢測(cè)E-鈣粘蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與口腔鱗狀細(xì)胞癌組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系，并進(jìn)一步探討E-鈣粘蛋作為判斷患者預(yù)后標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)的前景。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 試驗(yàn)組:收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院1991至2009年口腔鱗狀細(xì)胞癌蠟塊標(biāo)本60例(取標(biāo)本前未經(jīng)任何治療)，其中男38例，女22例;年齡41～77歲，平均年齡58.7歲;高分化31例，中度分化21例，低分化8例;標(biāo)本均經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師閱片后確診。對(duì)照組:正?？谇火つそM織40例，均取自囊腫旁及牙槽骨整形手術(shù)時(shí)切除的正常黏膜組織。其中男25例，女15例;年齡21～68歲，平均年齡40.5歲。

1.2 主要試劑與儀器 試劑:SP免疫組化試劑盒、一抗(購(gòu)自博士德分裝抗體)、DAB顯色劑、多聚賴氨酸(Poly－L-lysine)防脫片劑均購(gòu)于河北博海生物有限公司。儀器:LEICA石蠟切片機(jī)，ZHPY-型恒溫式附貼切片展片儀(河北醫(yī)科大學(xué))，多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus)、離心機(jī)(北京離心機(jī)廠，LDZ5-2型)、移液器(德國(guó)EPPENDORF)、低溫冰箱(日本三洋，MDF-382E型)、PGB/20-002臺(tái)式保溫培育箱(中華人民共和國(guó)重慶試驗(yàn)設(shè)備廠)、Olympus PM-10ADS型雙目顯微鏡。

1.3 對(duì)照試驗(yàn) 用已知的E-鈣粘蛋白陽(yáng)性的腸黏膜標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 試驗(yàn)方法 采用免疫組織化學(xué)SP法(過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素法)。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟重新包埋后，將每個(gè)蠟塊切為5 μm的切片，共切4張，1張HE染色，1張作為陰性對(duì)照，1張E-鈣粘蛋白染色。

1.5 結(jié)果判定 E-鈣粘蛋白以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色膜性染色作為正常表達(dá)的陽(yáng)性標(biāo)記。而位于細(xì)胞漿中或胞膜與胞漿共同有連續(xù)線狀或斑點(diǎn)狀黃色至棕黃色顆粒沉積者為異常陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)染色者為陰性表達(dá)。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率判定:(1)陰性:無(wú)染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%;(2)弱陽(yáng)性:胞漿染色淺，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26% ～50%;(3)中度陽(yáng)性:胞膜胞漿混合染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51% ～75%;(4)強(qiáng)陽(yáng)性:胞膜連線狀均勻染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組E-鈣粘蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較 E-鈣粘蛋白對(duì)照組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)38例(圖1)，呈異常陽(yáng)性2例，異常陽(yáng)性率5%;試驗(yàn)組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)21例，呈異常陽(yáng)性表達(dá)(包括陰性表達(dá))39例(圖2)，異常陽(yáng)性率65%，顯著高于對(duì)照組(χ2=35.72，P＜0.05)。

圖1 E-鈣粘蛋白在正?？谇火つぶ械谋磉_(dá)(SP×400)

圖2 E-鈣粘蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)(SP×400)

2.2 E-鈣粘蛋白的表達(dá)馬鱗癌的組織學(xué)分級(jí)關(guān)系 E-鈣粘蛋白的表達(dá)與鱗癌的組織學(xué)分級(jí)具有相關(guān)性，鱗癌的分化越低，E-鈣粘蛋白的異常陽(yáng)性率表達(dá)越高(P＜0.05)，而與患者性別、年齡無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 E-鈣粘蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與口腔鱗癌組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系例

表2 口腔鱗癌組織中E-鈣粘蛋白的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 例

3 討論

E-鈣粘蛋白是一類介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的上皮性鈣依賴性跨膜糖蛋白，基因位于16號(hào)染色體長(zhǎng)臂，分子量為120 kU。1999年克隆和提純了人類E-Cadherin基因(CDHI)，發(fā)現(xiàn)人類E-cad基因位于16q22.1，含有16個(gè)外顯子及15個(gè)內(nèi)含子。

E-鈣粘蛋白存在于所有上皮組織中。無(wú)論是在胚胎發(fā)育階段還是在成熟組織中E-鈣粘蛋白都起到了調(diào)節(jié)細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞間黏附、維持細(xì)胞極性、維持組織結(jié)構(gòu)性完整的重要作用。并在胚胎細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中影響細(xì)胞的分化，參與器官形成過(guò)程。研究人員很早就在小鼠上證明如果破壞E-鈣粘蛋白的基因，胚胎就不能發(fā)育，說(shuō)明生物早期的組織器官發(fā)生中，E-鈣粘蛋白的功能很關(guān)鍵，并有研究推測(cè)E-鈣粘蛋白與牙冠釉質(zhì)形成及牙根發(fā)育有關(guān)［3］。

E-鈣粘蛋白是一種重要的細(xì)胞黏附分子和信號(hào)傳導(dǎo)分子，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黏附系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用。做為近年來(lái)較為關(guān)注的抑癌因子其主要功能為控制細(xì)胞移動(dòng)，研究證明加強(qiáng)細(xì)胞間的黏附和抑制細(xì)胞增殖則是其實(shí)現(xiàn)抑癌功能的兩條途徑。E-鈣粘蛋白的功能下降或喪失則引起腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，這表明E-鈣粘蛋白活性減低與腫瘤的低分化、高侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］。因此E-鈣粘蛋白在抑制腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，是預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

正常口腔黏膜中，E-鈣粘蛋白在胞漿合成后，然后彌漫在胞膜，以膜性表達(dá)為主，且主要位于基底層和棘層，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。本試驗(yàn)中40例正?？谇火つ?biāo)本有38例呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色膜性染色，且E-cad主要表達(dá)于基底層至棘細(xì)胞層的細(xì)胞膜。

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔中的一種上皮性的惡性腫瘤，其特征是細(xì)胞間橋出現(xiàn)和角蛋白形成［5］。近年來(lái)病理學(xué)研究表明，細(xì)胞間橋的出現(xiàn)和鱗癌包括口腔鱗狀細(xì)胞癌的分化是相關(guān)的，高分化鱗癌中細(xì)胞間橋出現(xiàn)較多，細(xì)胞的黏附性較強(qiáng)，侵襲性及轉(zhuǎn)移力較弱，因此E-鈣粘蛋白的表達(dá)較強(qiáng)。而中度分化和低度分化的口腔鱗狀細(xì)胞癌中細(xì)胞間橋較少見(jiàn)，細(xì)胞間黏附因性差，具有較強(qiáng)的侵襲性轉(zhuǎn)移力。因此E-鈣粘蛋白的表達(dá)異?；蜉^弱甚至不表達(dá)。本試驗(yàn)中60例口腔鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)21例，呈現(xiàn)異常陽(yáng)性表達(dá)39例，異常陽(yáng)性率為65%顯著高于對(duì)照組，甚至在低分化鱗癌中出現(xiàn)62.5%的陰性表達(dá)。

Yamada等［6］用免疫組化方法檢測(cè)18例口腔鱗狀細(xì)胞癌中E-鈣粘蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)比正常口腔黏膜明顯減少甚至缺失，并且這種異常表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌的TNM分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分型相關(guān)。Chow等［7］對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌中E-鈣粘蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究，顯示E-鈣粘蛋白的表達(dá)下降或者消失導(dǎo)致腫瘤的侵襲性增強(qiáng)，預(yù)后差，同時(shí)與口腔鱗狀細(xì)胞癌的TNM分期明顯相關(guān)，E-鈣粘蛋白的表達(dá)的下降使腫瘤更容易復(fù)發(fā)。Yokoyama［8］通過(guò)研究在體外比較陰性表達(dá)E-鈣粘蛋白和陽(yáng)性表達(dá)E-鈣粘蛋白的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲力，發(fā)現(xiàn)陰性表達(dá)E-鈣粘蛋白的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲能力。因此，目前研究證實(shí)E-鈣粘蛋白與口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展密切相關(guān)，是判斷口腔鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為和預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移趨勢(shì)有價(jià)值的指標(biāo)。可以作為判定預(yù)后及指導(dǎo)治療的指標(biāo)，可能會(huì)成為抗轉(zhuǎn)移治療的靶點(diǎn)。

1 Morin PJ.Beta-catenin signaling and cancer.Bioesays，1999，21:1021-1030.

2 劉健，浦劍虹，葛自力，等.E-cda、CD44V6在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21:67-70.

3 李紓，劉琳.E-鈣粘蛋白在出生后小鼠牙齒發(fā)育中的表達(dá)和意義.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2004，14:670-673.

4 Stockinger A，Eger A，Wolf J.E-cadherin regulates cell growth by modulating proliferation-dependent beta-catenin transcriotional activity.J Cell Biol，2001，154:1185-1196.

5 唐瞻貴.E-cadherin基因蛋白在口腔疣狀癌中的表達(dá).湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，28:206-208.

6 Yamada K，Jordan R，Mori M，et al.The relationship between E-cadherin expression，clinical stage and tumor differentiation in oral squamous cell carcinoma.Oral Dis，1997，3:82-85.

7 Chow V，Yuen AP，Lam KY，et al.Acomparative study of the clinicopathological significance of E-cadherin and catenins expression in the surgical management of oral tongue carcnoma.J Cancer Res Clinoneol，2001，127:59-63.

8 Yokoyama K，Kamata N，Hayashi E，et al.Reverse correlation of E-cadherin and snai1 express in oral squamous cell careinoma cells in vltro.O-ral Oncol，2001，37:65-71.