富勒烯的化學修飾技術及其修飾產(chǎn)物在疾病預報中的應用

李園園，李志明，鄭志勇

?

富勒烯的化學修飾技術及其修飾產(chǎn)物在疾病預報中的應用

李園園1，李志明2*，鄭志勇2

（1.漳州科技職業(yè)學院，福建 漳州 363202；2.漳州職業(yè)技術學院，福建 漳州 363000）

開發(fā)了N ,N -二乙基苯胺(DEA)-富勒醇(F)-異硫氰酸熒光素（FITC）磷光標記試劑(DEA-F-FITC)及建立DEA-F-FITC標記伴刀豆凝集素(Con A)親和吸附(AA)固體基質(zhì)室溫燐光法(AA-SS-RTP)測定AFP-V新方法。該方法的靈敏度高(Pg/mL)為0.13(F)和 0.090(FITC)，用于測定人血清樣品中AFP-V的含量和人體疾病預報，結果都與酶聯(lián)免疫法的相吻合。

富勒烯；化學修飾技術；應用

1 引言

肝癌(HCC)是人體最常見的惡性疾病之一。當前HCC的診斷有化學免疫法[1],熒光診斷法[2], 磁性共振法[3], 三維投影放射性療法[4]等。遺憾的是上述診斷的方法僅處于定性、半定量水平。研究表明，AFP-V含量與原發(fā)性肝癌密切相關。Sato 等報道[5]，AFP-V升高的肝硬化病人大多數(shù)在3～18個月內(nèi)被診斷為肝癌患者。AFP-V預測HCC發(fā)生的正確率為94%[6]。國內(nèi)外測AFP-V含量的方法有親和電泳酶免疫法(LD =1.0×10–9ng/mL)[7]、親和吸附 (LD =9.0×10–10 g/mL)法[8]、時間分辨熒光免疫法(競爭法的LD = 9.4 ×10–10 g/mL，夾心法的LD =3.0×10–10 g/mL)[9]、抗體親和印跡法(LD< 4.0×10–7g/mL)[10]等。但諸類方法或是操作繁雜、費時、靈敏度不高, 難以滿足生物試樣中低含量AFP-V測定。顯然，探索高靈敏、準確測定AFP-V的新方法與預報HCC，在生命科學領域具有重要學術價值和應用前景。

凝集素、糖、糖鏈結構的研究已成為當前生物醫(yī)學領域中的熱點和前沿課題。近年來，凝集素作為一種糖基探針，已用于糖蛋白、糖脂、糖結構及堿性磷酸酶研究[11-12]。因此，尋找凝集素的高效標記試劑，已成為生物分析的關鍵。文獻報道了C50Cl10等富勒烯衍生物本身具有一定的發(fā)光特性。Caspar和Wang[13]曾用N ,N -二乙基苯胺(DEA)修飾C60，使其熒光大大增強。此研究測量的雖然是熒光信號, 顯然其原理對磷光亦是適合的。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，DEA對F、FITC在ACM上發(fā)射的室溫燐光(RTP)信號有顯著的增強作用。由此設想，用DEA修飾F、FITC的產(chǎn)物標記Con A的產(chǎn)物(DEA-F-FITC-Con A)與AFP-V發(fā)生AA反應，探索高靈敏AA-SS-RTP測定痕量AFP-V的可能性。本研究為SS-RTP的發(fā)展提出新的出路，同時推動富勒烯修飾技術與應用的進展。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LS-55型熒光分光光度計及固體前表面處理器，儀器參數(shù)：Delay 0.1ms，Gate 2.0ms，Cycle 20ms，F(xiàn)lash Count 1，Ex Slit 10nm，Em Slit 15nm，Speed 1500nm/min；KQ-250B型超聲波清洗器；AE240型電子分析天平；0.50 μL平頭微量注射器。

AFP-V、牛血清蛋白(BSA)、Con A購于sigma 公司，并保存于0－4℃冰箱中。臨用時分別稀釋成1.00、100.00(pg/mL)AFP-V、700.0 ng/mL Con A、10 mg/mL BSA、1.0×10–5mol/L F[14]; 1.0×10–5moL/L FITC；1%(V/V)DEA；0.10moL/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，0.067mol/L KH2PO4-Na2HPO4緩沖液；0.050mol/L Tris-HCl緩沖液；Tris-HCl-0.1%Tween-20洗滌緩沖液；10.0 mg/mL BSA包被液(0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3稀釋）；Tris(三羥甲基氨基甲烷），HCl，NaCl，Tween-20，1.0 moL/LPb(Ac)2溶液；HAc等。除了BSA為生物試劑外，其余試劑為分析純，水用三次亞沸蒸餾水。

聚酰胺素膜(PAM)、ACM、硝酸纖維素膜(NCM)購于路橋四甲生化塑料廠。預先剪切成Ф = 1.5 cm的圓片備用。

2.2 實驗方法

2.2.1 Con A的標記

用0.50μL微量進樣器，將0.4μL不同濃度與用量的Con A(W/V，pH=7.4的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液稀釋)懸空點樣在ACM的中心壓痕(Ф=4 mm)處，然后取出ACM，在ACM的中心壓痕處加0.4μL標記試劑(1.50mL 1% DEA-0.40mL1.0×10–5mol/L F-5.00 mL 1.0×10–5mol/L FITC)乙醇溶液。在37℃時靜置反應2h，得Con A與DEA-F-FITC反應而生成的標記產(chǎn)物(DEA-F-FITC-Con A）。取出標記產(chǎn)物，經(jīng)洗滌液沖洗，超聲波振蕩重復洗滌3次，除去ACM上未反應的標記試劑，用濾紙吸干，備用。根據(jù)DEA-F-FITC-Con A與AFP-V AA反應產(chǎn)物的RTP測量結果，篩選DEA-F-FITC標記Con A的最佳濃度與用量。

2.2.2親和吸附反應與室溫燐光檢測

采用夾心法進行親和吸附反應。在ACM的中心壓痕(Ф=4 mm)處，用0.5μL微量進樣器點加0.40μL的Con A于同一壓印痕處, 于4℃下放置過夜, 繼而在BSA包被液中37℃浸泡0.5 h，用0.50μL微量進樣器將0.4μL不同濃度的AFP-V溶液(用pH=9.12 Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液逐級稀釋)懸空點樣在PAM的中心壓痕(Ф=4 mm)處，于37℃下溫育2 h，再洗滌3次，用濾紙吸干；然后點加0.4μL已標記的Con A (DEA-F-FITC-Con A)于同一印痕處，于37℃下溫育2 h，再洗滌3次，用濾紙吸干；浸入Pb(Ac)2溶液中，10s后取出，于(90 ±1)℃下干燥2min，掃描其燐光光譜，記錄試劑空白(DEA-F-FITC-Con A+Con A)的p1和試樣(DEA-F-FITC-Con A- AFP-V- Con A)的p2，平行測定7份，計算?p(p2－p1)。

2.2.3樣品處理

取1.00 mL A、B、C、D、E、F人血清，加入0.50mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(含0.50 mol/L NaCl)，混勻10min，離心棄上清液后，再加入1.0mL緩沖液。混勻10min，置于4℃?zhèn)溆?。然后加入Sepharose 4B 吸附劑，離心棄上清液，用0.010mol/LTris-HCl 緩沖液稀釋至pg級，在振蕩器上振搖300 r/min 20min。經(jīng)200 r/min離心5min，按實驗方法測定上清液中的AFP-V同時做加入標準回收率實驗，并與漳州市中醫(yī)院ELSIA法臨床檢測的結果比較。

3 結果與討論

3.1 親和吸附產(chǎn)物的SS-RTP光譜

圖1 DEA- F-FITC-Con A-AFP-V- Con A法磷光光譜（F）

圖2 DEA- F-FITC-Con A-AFP-V- Con A法磷光光譜（FITC）

表1 DEA- F-FITC-Con A-AFP-V-Con A體系的磷光特性（F和FITC）

3.2 最佳測定條件

3.2.1試劑濃度與用量

對于40.0 fg AFP-V，按實驗方法檢測F和FITC的p值，分別考察試劑濃度和用量對體系的Δp值的影響。結果表明，試劑濃度與用量為0.40mL 1.0×10–5mol/L F、5.0 mL 1.0×10–5mol/L FITC、1.50 mL 1.0％DEA 時，體系的Δp值最大且穩(wěn)定。

3.2.2固體基質(zhì)

對于40.0 fg AFP-V，固體基質(zhì)分別為ACM、PAM、NCM時，體系中F的Δp依次為30.1、12.6與8.4 ，F(xiàn)ITC的Δp依次為 45.8、23.5與11.0。結果表明：采用ACM時FITC和F的Δp值都最大。

3.2.3增敏劑

對于40.0fg AFP-V，增敏劑分別為DEA、十二烷基磺酸鈉、聚丙烯酸鈉、溴代十六吡啶時，體系中F的Δp依次為30.1、12.5、16.6與24.4，F(xiàn)ITC的Δp依次為 45.8、32.9、39.3與45.5。結果表明：采用DEA時F和FITC的Δp值最大值，故采用DEA為增敏劑。

3.2.4離子微擾效應

對于40.0 fg AFP-V，離子微擾劑分別為1.00 mol/L的Hg2＋、Ba2＋、Pb2+、Ag+時，體系中F的Δp依次為26.3、22.1、30.1與17.5，F(xiàn)ITC的Δp依次為40.0、33.7、45.8與26.6；當Pb2+濃度分別為 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5時，體系中F的Δp依次為26.7、29.9 、30.1、30.0、29.9與29.9，F(xiàn)ITC的Δp依次為40.3、43.7、45.8、45.3、45.5 與45.5。選取1.00mol/L Pb2+為離子微擾劑時，Δp值最大且穩(wěn)定。

3.2.5. 烘干溫度與時間

對于40.0 fg AFP-V，分別研究了烘干溫度和時間對體系的Δp的影響。結果表明，烘干溫度分別為60、70、80、90、95(℃)時，體系中F的Δp依次為20.1、23.5、26.8、30.1與27.8，F(xiàn)ITC的Δp依次為30.6、35.7、40.8、45.8與41.5；當烘干時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0與2.5(min)時，體系中F的Δp依次為7.5、15.1、22.6、30.3 與 25.7，F(xiàn)ITC的Δp依次為11.5、23.0、34.5、45.8與41.5；其中90℃、2min時Δp值最大且穩(wěn)定。

3.2.6氧氣及濕度

對于40.0 fg AFP-V，按實驗方法考察氧氣及濕度對體系的Δp的影響。結果表明，通干燥N2分別為5、10、15、20、25、30、35 min時，體系F的?p依次為30.2、30.1、29.9、30.1、30.2、29.8、30.1，F(xiàn)ITC的Δp依次為45.7、45.8、45.6、45.8、45.6、45.7、45.8；不通干燥N2，時間為5、10、15、20、25、30、35 min時，體系F的?p依次為30.1、28.3、25.0、20.2、17.3、14.2、10.3，F(xiàn)ITC的Δp依次為45.4、41.5、39.8、35.7、30.9、27.6、24.7。表明，在通干燥的N2的條件下體系是穩(wěn)定的。

3.2.7 RTP發(fā)射的穩(wěn)定性

在上述條件下，體系放置時間為10、20、30、40、50、60 和70 min時，F(xiàn)的Δp依次為30.1、30.1、30.1、30.1、30.1、29.9 和29.9，F(xiàn)ITC的Δp依次為45.8、45.8、45.8、45.8、45.8、45.7和45.3；體系在50 min內(nèi)Δp值幾乎不變，重現(xiàn)性好。

3.3 工作曲線、檢出限和精密度

用F-FITC-DEA標記Con A，親和吸附方式測定AFP-V，其含量與Δp值成線性關系。工作曲線、線性系數(shù)、檢出限（按3b/,= 11計算）和相對標準偏差 (%)等列于表2。表明親和吸附方式測定AFP-V的靈敏度高、線性范圍寬和精密度好。

表2 方法的檢出限、精密度

3.4 人血清中AFP-V含量的測定與人體疾病預報

取1.00 mL上清液，按實驗方法測定上清液中的AFP-V, 同時做加入標準回收率實驗，并與漳州市中醫(yī)院ELSIA法臨床檢測的結果比較（表3）。

表3 人血清中AFP-V含量的分析結果

注：“+”表示有占位性病變，“－”未見占位性病變。

由表3可見, 本法的RSD%為1.5－4.3(%)，回收率%為98.4－103(%)。無論選用F或FITC法測定人血清樣品中AFP-V的含量，其結果與酶聯(lián)免疫法(ELISA)的相吻合。根據(jù)AFP-V含量＞355.6μg/L，臨床診斷A、B、C患有PHC；AFP-V含量＜355.6μg/L，臨床診斷D、E、F為健康人。此后，對A、B、C進行治療，4周后用本法測定血清中AFP-V含量＜355.6μg/L，表明已達到健康人的水平。經(jīng)B超、CT等檢查，未見占位性病變。由此表明，本方法不僅適用于人血清中AFP-V含量的測定，還可用于人體疾病的測報。

4 結語

將高靈敏的SS-RTP與AA反應的高特異性相結合，建立了靈敏、準確測定痕量AFP-V新方法。新的F-FITC磷光標記試劑的開發(fā)與應用，不僅提高了AA-SS-RTP的靈活性和適應性，而且為F、凝集素提供了新的應用領域。

[1] G. Becker, A. Schmitt-Graeff, V. Ertelt, et al. Allgaier. CD117 (c-kit) expression in human hepatocellular[J]. Clinical Oncology, 2007,19(3):204-208.

[2] Constance Lay Lay Saw, Malini Olivo, William Wei Lim Chin, et al. Superiority of N-methyl pyrrolidone over albumin with hypericin for fluorescence diagnosis of human bladder cancer cells implanted in the chick chorioallantoic membrane model[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology,2007,86(3):207-218.

[3] Hui Xu PhD, Xuan Li MD, Jing-Xia Xie MD, et al. Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging of Focal Hepatic Nodules in an Experimental Hepatocellular[J]. Academic Radiology, 2007,14(3):279-286.

[4] Tae Hyun Kim M.D., Dae Yong Kim M.D., Joong-Won Park M.D.,et al. Dose–volumetric parameters predicting radiation-induced hepatictoxicity in unresectable hepatocellular carcinoma patients treated with three-dimensional conformal radiotherapy[J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, 2007,67(1):225-231.

[5] Y. Sato, K. Nkata, Y. Kato. Early recognition of hepatocellular carcinoma based on altered profiles of alpha-fetoprotein[J]. N Engl J Med, 1993,328(25):1802- 1806.

[6] Tu ZX, Yin ZF, Wu MC. Prospective study on the diagnosis of hepatocellular carcinoma by using alpha-fetoprotein reactive to Lentil lectin[J]. Chin Med Sci J , 1992,7(4) : 191- 195.

[7] 齊為民,張麗君,劉樹林,等.親和電泳酶免疫法快速測定AFP 異質(zhì)體[J].免疫學雜志，2001,17(4):313-317.

[8] 汪子偉,卓廣超,冷建杭,等.甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附法測定[J].中國腫瘤，2003,12(2):120-121.

[9] 韓玲,陳杞. 人甲胎蛋白異質(zhì)體直接固相時間分辨熒光免疫測定[J].上海免疫學雜志，1993,13(4):227-228.

[10] 龐春梅,沈鼎明,王景. 血清AFP異質(zhì)體印跡法和γ-GTⅡ定性、定量檢測對原發(fā)性肝癌診斷價值的探討[J].重慶醫(yī)科大學學報，2000, 25(3):259-264.

[11] Ying, X.; Hu, D.W.; Low, Y.C.; et al. One-step method of labeling triticum vulgare lectin and cellulose with colloidal gold probe[J]. Electron Microscopy Society, 2000,19(2):179-183.

[12] Allen; Allen, L.C.V.; Breur, M.J.; et al. A comparison of two techniques for the determination of serum bone-specific alkaline phosphatase activity in dogs[J]. Sci. 2000,68(3):231-235.

[13] Caspar J V, Wang Y. Excited State Electron Transfer of Fullerenes. Singlet States Versus Triplet States[J]. Chem. Phy s. L ett. , 1994,218:221-228.

[14] Tian-Bao LI，Ke Xiong HUANG，Xin Hai LI, et al. Studies on the Rapid Preparation of Fullerols and Its Formation M echanism[J]. Chem. J Chinese Universities，1998,19(6):858-860.

Chemically Modified Technique of Fullerene and its Application in Diseases Prediction

LI Yuan-yuan1, LI Zhi-ming2, ZHENG Zhi-yong2

（1.Zhangzhou college of science & technology Zhangzhou, 363202, China 2.Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou, 363000, China）

The phosphorescent labeling reagent N, N-dimethylaniline-fullerol-fluorescein isothiocyanate (DEA-F-FITC) has been developed. A new affinity adsorption-solid substrate-room temperature phosphorimetry (AA-SS-RTP) for the determination of alpha-fetoprotein variant (AFP-V) had been established, based on DEA-F-FITC as a labeling reagent of concanavalin agglutinin (Con A). This method has high sensitivity (The detection limits (Pg/mL) are 0.13 for F and 0.090 for FITC, respectively), which has been applied to the determination of trace AFP-V in human serum and the forecast of human diseases, and the results agreed well with those obtained by enzyme-linked immunoassay.

Fullerene; Chemically modified technique;Application

2012－09－30

福建省教育廳科技項目資助（JB11308）

李園園(1983－)，女，山東菏澤人，助教。主要從事化學方面研究。 通訊作者聯(lián)系電話0596-2660301，電子郵件：zzylzm@163.com。

O613.71

A

1673-1417（2012）04-0007-06

（責任編輯：季平）