固體基質(zhì)室溫磷光法測(cè)定痕量卡維地洛

林常青，孫莉娜，林 洵

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固體基質(zhì)室溫磷光法測(cè)定痕量卡維地洛

林常青，孫莉娜，林 洵

（漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系, 福建 漳州 363000）

提出一種簡(jiǎn)便、靈敏、選擇測(cè)定卡維地洛（CV）的固體基質(zhì)室溫磷光法（SS-RTP）。所發(fā)展的方法是基于十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）增敏CV活化NaClO氧化莧菜紅（A）反應(yīng)而導(dǎo)致體系的室溫磷光（RTP）的劇烈猝滅。與無SDBS時(shí)比較，體系的磷光增強(qiáng)度(Δp)增大17.5倍，并且CV含量在0.200-40.0 pg/mL范圍內(nèi)與Δp值成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9976，檢出限為5.1 × 10?14 g/mL(取樣量為0.40 μL），具有很高的靈敏度。此外，此靈敏的方法用于測(cè)定人血清中殘留CV含量的測(cè)定，結(jié)果與同步熒光法.相吻合。該反應(yīng)的活化能(E)與速率常數(shù)()為69.04 Kj/mol 與 3.580×10?4/s。

卡維地洛；莧菜紅；增敏；活化；固體基質(zhì)室溫磷光法

1 引言

卡維地洛（CV）是一種非選擇性β受體阻滯劑，用于抗心絞痛的高血壓藥物，并也可用于充血性心力衰竭的治療。與此同時(shí)，CV被世界反興奮劑機(jī)構(gòu)和國(guó)際奧林匹克委員會(huì)列為違禁藥物之一。因此，研究CV含量的測(cè)定方法對(duì)人體疾病的預(yù)警與防治以及反興奮劑的體育運(yùn)動(dòng)具有重要意義和應(yīng)用前景。

當(dāng)前用于測(cè)定生物試樣如血漿，血清，尿液中的CV的方法有液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法 (LD= 0.20 ng /mL)[1]，液相色譜熒光法 (LD = 1.56 ng/mL)[2]，高效液相色譜電化學(xué)法 (LD = 0.10 ng/mL)[3]，氣相色譜-質(zhì)譜法 (LD = 0.30 ng/mL)[4]和 LC-LC-熒光檢測(cè)耦合法 (LD = 0.70 ng/mL)[5]。但是，這些方法有諸多局限，比如耗時(shí)、樣品處理過程繁瑣毒性大、靈敏度低、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、儀器昂貴、不利推廣利用等。有些化學(xué)家雖然建立了簡(jiǎn)便的方法，如高靈敏的流動(dòng)注射熒光光譜法(LD = 3.63 × 10?9mol/L)[6]和化學(xué)發(fā)光法 (LD = 8.7 × 10?9mol/L)[7]，但其背景的干擾大，選擇性較差，且推廣應(yīng)用有一定的局限性；上述方法的靈敏度僅達(dá)ng級(jí)，不能滿足pg級(jí)CV 測(cè)定的需求。因此探索高靈敏、高選擇性、簡(jiǎn)便、快速測(cè)定CV含量的新方法具有重要的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。

室溫磷光(RTP)作為一種檢測(cè)手段具有Stokes' 位移大、易于減少或消除本底熒光和散射干擾、發(fā)光壽命長(zhǎng)等優(yōu)良特性。基于RTP的變化，建立的催化SS-RTP (LD = 5.2×10?20g/mL寶泰松)[8]、抑制SS-RTP (LD = 6.5×10?12g/mL托布他林)[9]、SSRTP傳感器[10]、磷光開關(guān)SSRTP[11]、曙紅Y分子自組裝SSRTP[12]和離子印記SSRTP[13]、離子締合SSRTP[14]及固體基質(zhì)室溫磷光免疫法[15]等，充分顯示了SS-RTP用量少，操作簡(jiǎn)便靈活、高靈敏、高選擇性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。其中，催化SS-RTP、分子自組裝SSRTP、固體基質(zhì)室溫磷光免疫法和離子締合SSRTP是分別借助催化反應(yīng)的信號(hào)放大效應(yīng)、曙紅Y分子自組裝、二溴熒光素納米微球及增加配位體發(fā)光分子數(shù)目等途徑，以增加生物靶上的RTP信號(hào)，從而提高SSRTP的靈敏度。采用其它途徑進(jìn)一步提高SSRTP的靈敏度是當(dāng)今SSRTP的研究熱點(diǎn)。

本研究的目的是開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、選擇性和靈敏度好的測(cè)定CV的SS-RTP。在深入探討檢測(cè)興奮劑新方法的實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谙跛崂w維素膜（NCM）上不僅觀察到莧菜紅(A)能發(fā)射穩(wěn)定的RTP，而且發(fā)現(xiàn)A能被NaClO氧化而發(fā)生RTP猝滅，CV被NaClO氧化而生成氯胺，生成的氯胺與A發(fā)生反應(yīng)，使A被進(jìn)一步氧化，顯示CV對(duì)NaClO氧化A反應(yīng)有強(qiáng)的活化作用。更有意義的是十二烷基苯磺酸鈉(SDBS）可增敏CV活化NaClO氧化A的反應(yīng)，從而導(dǎo)致RTP信號(hào)的劇烈猝滅。與無SDBS時(shí)比較，SDBS存在時(shí)體系的Δp增大17.5倍，為提高SSRTP的靈敏度提供新的途徑。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們考察了SDBS增敏CV活化NaClO氧化A的SS-RTP測(cè)定CV的可行性、最佳測(cè)定條件、分析參數(shù)與分析應(yīng)用。此外，所創(chuàng)建的增敏CV活化SS-RTP及其測(cè)定痕量CV的機(jī)理鮮見文獻(xiàn)報(bào)道外，本方法對(duì)維護(hù)體育賽事的公平性和探討藥物分析的發(fā)展具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。本研究不僅推動(dòng)SS-RTP與興奮劑檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，而且促進(jìn)體育運(yùn)動(dòng)的健康發(fā)展。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LS-55型熒光分光光度計(jì)及固體前表面處理器（貝克曼有限公司, 美國(guó)）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；pHS-3B酸度計(jì)；80-2 離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；0.5μL平頭微量注射器（上海醫(yī)用激光儀器廠）。

CV工作溶液：稱取0.00500 g CV標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma), 用1mL of 4.0% (m/v) 乙醇溶液溶解，并定容至50.0 mL。此標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的濃度為0.10 mg/mL。臨用時(shí), 用水溶液稀釋成100.00 fg/mL，避光存放。1.00×10?2mol/LA的水溶液: 0.6045 g用水溶解，并定容到100 mL, 臨用時(shí)逐級(jí)稀釋。NaClO溶液的配制：10% NaClO臨用時(shí)逐級(jí)稀釋制得。SDBS溶液: 稱取3.00gSDBS, 用水溶液溶解，并定容至100.0 mL，臨用時(shí)逐級(jí)稀釋制得所需濃度。Britton-Robinson緩沖溶液（pH 11.2）﹕在100 ml三酸混合液（磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.040 mol/L）中，加入85.0ml的0.2mol/LNaOH，混合均勻即得。除了CV為基準(zhǔn)試劑外，其它為分析純, 水為三次石英亞沸水。

定量濾紙、聚酰胺素膜（PAM）、醋酸纖維素膜（ACM）與NCM購于杭州新華紙業(yè)有限公司。預(yù)先剪切成直徑為 1.5厘米的圓片備用。

2.2 人血漿樣品制備

參考文獻(xiàn)[16]方法，10名男性健康志愿者參加受試，年齡(21.5±1.42)歲，身高(170.0±4.85)cm，體重(69.2± 8.13)kg，受試者無心、肝、腎等病史，無低血壓史。試驗(yàn)前及試驗(yàn)期間未用任何藥物，并禁煙酒。試驗(yàn)期間進(jìn)統(tǒng)一食譜且低脂飲食。研究方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。每名志愿者于早晨(試驗(yàn)前禁食10 h 以上)空腹口服 1 mg CV試劑片（25 mg, 批號(hào)為 20090103，寧波市天衡制藥有限公司），用250 mL水送服。受試者服藥后4h 內(nèi)保持臥位，服藥2 h 后飲水，并在 4h 后進(jìn)食統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)午餐。

受試者分別于給藥前取空白血樣，給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 由肘靜脈各取血5mL，每次取血均應(yīng)在上述指定時(shí)間前后2min內(nèi)完成。將采集到的血樣置肝素化離心管中，離心（3000 r/min）15 min，血漿轉(zhuǎn)移至塑料管中置－20 ℃冰箱保存，一周內(nèi)測(cè)定。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

往25 mL比色管中加入適量CV，2.00 mL A，1.50 mL SDBS，2.00 mL B-R，2.00 mLNaClO，水定容，混勻，50℃水浴加熱10 min，水流冷卻5 min，取NCM（Ф = 15 mm）壓痕（Ф= 4.0 mm），浸入1.00 mol/L Pb2+溶液10秒后，于90±1℃干燥2.5 min, 用0.50 μL平頭微量注射器懸空點(diǎn)樣0.40 μL，90±1 ℃下干燥2.5 min，同時(shí)做試劑空白。掃描體系的磷光光譜，記錄466 /630(nm)處的p1和p2，計(jì)算Δp值。

3 結(jié)果與討論

3.1 磷光光譜

按實(shí)驗(yàn)方法掃描SDBS增敏CV活化NaClO氧化A體系的磷光光譜（圖1）。結(jié)果表明，在B-R緩沖溶液中50℃、10 min 的條件下，雖然Pb2+離子微擾劑能增強(qiáng)A從單線態(tài)向三線態(tài)躍遷的幾率，使A在NCM固體基質(zhì)上發(fā)射RTP（圖1曲線5.，λem= 644.7 nm，p= 65.2），但A卻被NaClO氧化成為在644.3 nm處不發(fā)射RTP的化合物，從而導(dǎo)致A-B-R buffer體系的RTP猝滅（圖1曲線6.6'，λem= 644.3 nm，p= 61.4，Δp= 3.8)。當(dāng)往A-NaClO-B-R buffer體系中加入1000.0 pg CV時(shí)，加速體系的RTP猝滅（圖1曲線7. λem= 644.6 nm，p= 54.9），顯示了CV能活化NaClO氧化A的反應(yīng)。然而，體系的Δp（6.5）很小，無分析價(jià)值。當(dāng)SDBS存在時(shí)，A-NaClO-B-R buffer-CV體系的RTP劇烈猝滅（圖1曲線4.，λex/λem= 634.8 nm，p= 171.3），且λemmax藍(lán)移了11.1 nm，可能是SDBS與A作用形成膠束化合物（SDBS-A）。該SDBS- A對(duì)CV活化NaClO氧化A的反應(yīng)有強(qiáng)的增敏效應(yīng)，導(dǎo)致體系的△p（113.5）比無SDBS時(shí)的△p（6.5）增大17.5倍。此實(shí)驗(yàn)事實(shí)為增敏活化NaClO氧化A的SS-RTP測(cè)定CV提供可能性。

圖1 SDBS增敏CV活化NaClO氧化A體系的磷光光譜圖

3.2 最佳條件

對(duì)于CV 20Pg/mL，分別考察試劑的濃度與用量、反應(yīng)酸度、反應(yīng)溫度和時(shí)間、干燥溫度和時(shí)間、固體基質(zhì)、增敏劑、離子微擾劑、通氮?dú)鈺r(shí)間與放置時(shí)間等對(duì)體系Δp的影響，結(jié)果表明，當(dāng)選用2.00 mL of 1.0×10?4mol/LA, 2.00 mL of 0.50% NaClO, 1.50 ml of 1.00% SDBS, 2.00 mL of pH 10.88 B-R and 1.00 mol/LPb2+、反應(yīng)pH為10.88－11.40、反應(yīng)溫度為50 ℃和反應(yīng)時(shí)間為10 min、干燥溫度為90 ℃和干燥時(shí)間為2.5 min、固體基質(zhì)為NCM、增敏劑為SDBS、離子微擾劑為Pb2+和通干燥N2時(shí)間為10 min時(shí)，體系的Δp最大。自取出水流冷卻5min 后始計(jì)，在5-35 min內(nèi)體系中的 Δp幾乎不變。

3.3 動(dòng)力學(xué)常數(shù)

對(duì)于CV 20Pg/mL，在30－50 ℃范圍內(nèi)，1/T與– log[logp0/p] 呈正相關(guān)，其回歸方程為–[p0/p] = ?7.284+ 2.682×1000/ T，r = 0.9963，當(dāng)T = 323 K時(shí)，活化能(E)= 69.04 Kj/mol。對(duì)于CV 200 Pg/mL，在2―10 min范圍內(nèi)，t與lnp0/p線性相關(guān)，其回歸方程為p0/p= ?0.0259 + 0.0218(min), r = 0.9960，當(dāng)t = 10 mim時(shí)，速率常數(shù)(k)= 3.58 × 10?4/s。

3.4 工作曲線、線性范圍、檢出限

本法CV含量在0.200-40.0 pg/mL (取樣量為0.40 μL）范圍內(nèi)與Δp值成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9976，對(duì)CV 0.25 pg/mL和40.0pg/mL進(jìn)行8次平行測(cè)定,RSD分別為 1.4%、3.7%，檢出限5.1 × 10?14g/mL（對(duì)試劑空白進(jìn)行11次測(cè)定，求得p平均值為284.8，b為0.045。按3×b/及0.40μL取樣量）。

3.5 干擾實(shí)驗(yàn)

用本法測(cè)定 CV 20.0 pg/mL，當(dāng)相對(duì)誤差（Er）為 ± 5 ℅ 時(shí)，本法比文獻(xiàn)[11, 12]方法的共存離子(物)允許濃度高，選擇性好。

3.6 樣品分析

各取1.00 mL試液，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定血漿樣本中的CV含量，顯示了血漿中CV的平均濃度與時(shí)間的關(guān)系：在服用量為78.91 pg/mL水平的CV1.5小時(shí)后血漿濃度達(dá)到最大值，最低檢出濃度為0.80 pg/mL（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤ ± 5%）。測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)[2]變化趨勢(shì)相吻合，并且其Er (%) ≤ ± 5%，表明本方法具有高的準(zhǔn)確度與精密度。

同時(shí)，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。由表1可知，本方法的回收率為 96.4%－102 %，RSD 在 1.2－1.6%，測(cè)定結(jié)果與SF相吻合，表明本方法具有高的準(zhǔn)確度，適用于血漿樣品中CV的測(cè)定。

表1 分析結(jié)果(n = 6)

4 結(jié)束語

基于SDBS增敏CV活化NaClO氧化A反應(yīng)而導(dǎo)致體系的室溫磷光劇烈猝滅的現(xiàn)象，提出了增敏活化SS-RTP測(cè)定CV的新方法及其反應(yīng)機(jī)理。本研究發(fā)展了新的SS-RTP與CV殘留分析技術(shù)，為興奮劑的檢測(cè)提供新的方法,為提高SSRTP的靈敏度提供新的途徑。同時(shí)，為人體疾病的預(yù)警與防治提供臨床診斷依據(jù)，推動(dòng)體育運(yùn)動(dòng)的健康發(fā)展。

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Determination of trace carvedilol by solid substrate-room temperature phosphorimetry

LIN Chang-qing, SUN Li-na, LIN Xun

（Department of Food and Biological Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou, 363000, China）

This work proposes a simple and sensitive solid substrate-room temperature phosphorimetry(SS-RTP) for selective determination of carvedilol (CV). The developed method is based on the sensitizing effect of sodium dodecyl benzene sulfonate (SDBS) on CV to activate the oxidation between NaClO and amaranth (A) resulting in the intense quenching of room temperature phosphorescence (RTP) of the system. Compared with non-SDBS system, the reducing value of phosphorescence intensity (Δp) with SDBS is 16.5 times higher and is directly proportional to the content of CV covering a wide range of 0.200－40.0pg mL?1, with a low detection limit (LD) of 5.1×10?14 g mL?1(sample volume: 0.40 μL). Additionally, this sensitive method has been applied to determine trace CV in human plasma, and results were analysed with synchronous fluorimetry (SF). The activation energy () and rate constant () of this activating reaction were 69.04 kJ mol?1and 3.580×10?4s?1.

Carvedilol; Amaranth; Sensitizing; Activating; Solid substrate-room temperature phosphorimetry

2012－09－20

漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技資助項(xiàng)目(ZZY1217)

林常青(1963－)，男，福建龍海人，教授。

O629.8

A

1673-1417（2012）04-0013-05

（責(zé)任編輯：季平）