以ITS為主要成分的無血清培養(yǎng)基對軟骨細(xì)胞增殖和表型的影響

劉瑾春 康 寧 肖 苒 劉霞 曹誼林

·論著·

以ITS為主要成分的無血清培養(yǎng)基對軟骨細(xì)胞增殖和表型的影響

劉瑾春 康 寧 肖 苒 劉霞 曹誼林

目的觀察以ITS為主要成分的無血清培養(yǎng)基對軟骨細(xì)胞增殖和表型的影響。方法培養(yǎng)豬耳軟骨細(xì)胞，分為無血清組和含血清組，無血清組應(yīng)用包含胰島素鐵硒傳遞蛋白（ITS）、地塞米松及維生素C為主要成分的無血清培養(yǎng)基；含血清組應(yīng)用包含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基。觀察平面和三維培養(yǎng)狀態(tài)下無血清培養(yǎng)基對軟骨細(xì)胞增殖、基質(zhì)分泌和軟骨表型維持的作用。結(jié)果平面培養(yǎng)條件下，無血清組的細(xì)胞增殖率出現(xiàn)下調(diào)，細(xì)胞表型不能維持。在三維培養(yǎng)情況下無血清組可以保持軟骨細(xì)胞存活和軟骨細(xì)胞的表型，Ⅱ型膠原和蛋白多糖組織學(xué)染色結(jié)果與含血清組無明顯差異，軟骨特異基因ColⅡ、Aggrecan的表達(dá)與含血清組無明顯差異，并能夠形成較好的軟骨樣組織。結(jié)論以ITS、地塞米松及維生素C為主要成分的無血清培養(yǎng)基，在三維培養(yǎng)條件下能基本保持軟骨細(xì)胞的存活和表型，可用于軟骨細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)。

無血清培養(yǎng)基胰島素鐵硒傳遞蛋白組織工程軟骨表型

目前體外單層或者三維培養(yǎng)軟骨細(xì)胞最常用的培養(yǎng)基為DMEM或F12培養(yǎng)基，同時添加10%的胎牛血清（FBS），血清在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的主要作用是提供細(xì)胞增殖所必需的生長因子，以促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖[1]。但是不同批號血清很難保證實驗條件的一致性，必然對實驗數(shù)據(jù)的精度和可靠性產(chǎn)生一定影響[2]；從臨床應(yīng)用的角度，體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中動物血清成分會引起不必要的免疫反應(yīng)；同時由于血清的成分十分復(fù)雜，在對細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行分析或提純時必然受到血清成分的干擾[3]。而應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，具有降低成本、避免血清潛在因素的影響、提高實驗結(jié)果的可重復(fù)性及降低污染率等優(yōu)點[4]。

胰島素在軟骨組織的發(fā)生和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，缺乏胰島素會導(dǎo)致嚴(yán)重的軟骨發(fā)育異常。胰島素可以在三維培養(yǎng)的情況下促進(jìn)軟骨細(xì)胞生存并保持軟骨表型[5]。胰島素鐵硒傳遞蛋白（Insulin-Transferrin-Selenium，ITS）是胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒的混合物[3]。ITS已經(jīng)被應(yīng)用于組織工程軟骨的構(gòu)建、軟骨細(xì)胞的擴增和再分化[6-7]。糖皮質(zhì)激素和維生素C在軟骨組織的發(fā)生和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。糖皮質(zhì)激素可以增加軟骨細(xì)胞的生存率，抑制軟骨細(xì)胞肥大，有利于軟骨細(xì)胞表型的維持[8]。維生素C能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，保持軟骨細(xì)胞的特性和表型[9]。以ITS、地塞米松和維生素C為主要成分的無血清培養(yǎng)基能否促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)和保持軟骨細(xì)胞表型，最終形成良好的組織工程軟骨，值得進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素（Gibco，USA）；10%胎牛血清FBS（Hyclone，USA）；膠原酶NB4、0.25%胰蛋白酶（Sigma，USA）；Ⅱ型膠原單克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；胰島素鐵硒傳遞蛋白ITS（北京邁晨科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄酶（Promega，USA）。

恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermo，USA）；超凈工作臺（上海博迅實驗器材公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon ECLIPSE TS100，Japan）；高速恒溫冷凍離心機（Hitachi，Japan）；PCR儀（Bio-RAD，USA）；電泳儀（DYY-7C型，北京六一儀器廠）；凝膠成像分析儀（Biospectrun AC，USA）。

1.2 軟骨細(xì)胞平面培養(yǎng)和檢測

1.2.1 軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)

無菌取豬耳軟骨，切成0.3 cm×0.3 cm×0.1 cm大小，PBS沖洗3遍，0.25%胰蛋白酶預(yù)消化30min，以0.15%的Ⅳ型膠原酶消化8～12 h，過濾、離心、洗滌、計數(shù)。以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，按2.0×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5% CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)。48 h后首次換液，待細(xì)胞生長近80%匯合后，以0.25%胰蛋白酶+ 0.02%EDTA消化收集，常規(guī)傳代至第2代后以2.0×104cells/mL密度接種于96孔板（100μL/孔）和6孔板培養(yǎng)皿（4 mL）中，置37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 軟骨細(xì)胞爬片和HE染色

第二代軟骨細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)基的不同分為含血清組和無血清組。含血清組pellets進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基包括低糖DMEM培養(yǎng)液、1%青霉素和鏈霉素、10%FBS；無血清組培養(yǎng)基包括低糖DMEM培養(yǎng)液、1%胰島素鐵硒傳遞蛋白（ITS）、100μg/m L丙酮酸鈉、50μg/m L維生素C、40μg/m L脯氨酸、10-7 M地塞米松、1%青霉素和鏈霉素。制備無菌玻璃細(xì)胞爬片，置于培養(yǎng)皿底部，軟骨細(xì)胞以2.0×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，分別在兩組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到80%融合后行細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，行HE染色。

1.2.3 測量MTT生長曲線

第二代軟骨細(xì)胞按照上述培養(yǎng)條件分為無血清組和含血清組，接種于96孔板內(nèi)，每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)為2 000個。細(xì)胞增殖情況通過MTT法來評估[10]。在第1～7 d的同一個時間點，每孔加入100μL MTT溶液（5 mg/m L，pH 7.4，PBS液溶解），培養(yǎng)4 h棄去培養(yǎng)液，每孔加1m L DMSO，在搖床上裂解10min，于490 nm波長處測定裂解液的光吸收值。每個時間點每組取6個平行樣本進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.4 RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞表型

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，調(diào)整RNA濃度為1μg/μL，-80℃保存。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（共20μL）和反應(yīng)程序：10mM dNTP 1μL、Oligod T 1μL、RNA 500 ng及ddH2O共11μL，65℃，5min；5×buffer 4μL、DDT 2μL，37℃，2 min；M-MLV 1μL，37℃，1 h；70℃，15min。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物均由北京賽百盛公司合成，檢測ColⅡ、Aggrecan及18S的基因表達(dá)（表1）。未表明出處的引物序列為引物設(shè)計軟件Gene Runner（version 3.05）設(shè)計，序列的特異性通過National Center for Biotechnology Information（NCBI）在線工具BLAST進(jìn)行驗證。

PCR反應(yīng)體系：ddH2O 17.4μL、Tag-mix 10μL、上游引物0.8μL、下游引物0.8μL、cDNA 1μL。PCR反應(yīng)程序：94℃1 min，94℃30 sec，退火溫度30 sec，7 2℃30 sec，重復(fù)35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在含有0.1 mg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)顯像。

1.3 軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)和檢測

1.3.1 軟骨細(xì)胞聚集體（pellets）的形成

取第二代軟骨細(xì)胞制成5×105cells/m L細(xì)胞懸液，將1 m L細(xì)胞懸液加入15 m L離心管內(nèi)用于制成一個pellet，600 g離心5 min。細(xì)胞在離心管底部形成細(xì)胞聚集體（5×105cells），擰松15m L離心管蓋，置37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。P2聚集體（pellets）根據(jù)培養(yǎng)基的不同分為含血清組和無血清組，分組方法同前。3 d后首次換液，培養(yǎng)2周。每組重復(fù)4個。

1.3.2 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測

取材后將標(biāo)本放入4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切成5μm厚切片，進(jìn)行HE染色、番紅O染色和甲苯胺藍(lán)染色，觀察細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAG）的分泌情況。免疫組化染色：3%過氧化氫溶液室溫下放置10 min阻斷內(nèi)源性酶，PBS沖洗，0.4%胃蛋白酶37℃消化30min，PBS沖洗，加入1∶100的鼠抗Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃過夜，37℃復(fù)溫1 h，PBS沖洗，加入羊抗鼠二抗，37℃下靜置40 min，應(yīng)用DAB顯色試劑盒顯色4～6min，蘇木素2min襯染。

1.3.3 RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞表型

Trizol法提取總RNA，檢測ColⅡ、ColⅩ、Sox 9、Aggrecan、ColⅨ及18S的基因表達(dá)（表1），方法同前。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

定量指標(biāo)均以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，所測數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVN）進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05為具有顯著性差異，統(tǒng)計軟件包為SPSS 16.0。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞平面培養(yǎng)時MTT曲線及HE染色觀察細(xì)胞活力和增殖能力

MTT比色法顯示含血清組軟骨細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量整體呈升高趨勢，培養(yǎng)第5天進(jìn)入平臺期；無血清組整體細(xì)胞數(shù)量沒有明顯的增加（圖1）。兩組軟骨細(xì)胞均在培養(yǎng)30 min后大量貼壁，9 h后基本全部貼壁。培養(yǎng)3 d后細(xì)胞爬片顯示含血清組的細(xì)胞覆蓋面積較無血清組稍大，兩組細(xì)胞形態(tài)相似（圖2）。

圖1 平面培養(yǎng)時兩組軟骨細(xì)胞的MTT生長曲線Fig.1 M TT assay of chondrocytes in serum-containing group and serum-free group under monolayer cu lture

圖2 平面培養(yǎng)時軟骨細(xì)胞組織學(xué)觀察（標(biāo)尺：100μm）Fig.2 Histologicalobservation of chondrocytes unde r m onolayer cultu re(Scale:100μm)

2.2 軟骨細(xì)胞平面培養(yǎng)時軟骨特異基因的表達(dá)

前3天兩組的表達(dá)水平及趨勢相似，在第7天無血清組Aggrecan和ColⅡ的表達(dá)減弱，而含血清組則隨著培養(yǎng)時間的延長，Aggrecan和ColⅡ的表達(dá)逐漸增強（圖3）。

圖3 平面培養(yǎng)時兩組軟骨細(xì)胞Aggrecan和ColⅡ表達(dá)比較Fig.3 Exp ression of Aggrecan and ColⅡin serumcontaining group and serum-free group under m onolayer culture

2.3 軟骨細(xì)胞pellets大體觀察和濕質(zhì)量比較

培養(yǎng)2周時無血清組和含血清組的軟骨細(xì)胞pellets均隨培養(yǎng)時間的延長體積逐漸增大，外觀瓷白色、半透明且有彈性。無血清組軟骨細(xì)胞pellets的體積、濕質(zhì)量明顯大于含血清組，但是組織厚度低于含血清組（P＜0.05）（圖4）。

圖4 體外培養(yǎng)2周時兩組軟骨細(xì)胞pellets大體觀和濕質(zhì)量比較Fig.4 Gross view and wetweightof the chondrocyte pellets in serum-containing group and serum-free group 2 weeks after culture

2.4 軟骨細(xì)胞pellets HE、甲苯胺藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫組化染色

HE染色可見兩組均有陷窩樣結(jié)構(gòu)形成，甲苯胺藍(lán)、番紅O染色和Ⅱ型膠原染色結(jié)果顯示，無血清組和含血清組無明顯差異（圖5）。

圖5 體外培養(yǎng)2周，軟骨細(xì)胞pellets組織學(xué)和免疫組化染色結(jié)果（標(biāo)尺：100μm）Fig.5 Histological and immunohistochem ical observation of the chondrocyte pellets 2weeksafter culture(Scale:100μm)

2.5 無血清組和含血清組軟骨細(xì)胞pellets基因的表達(dá)比較

PCR結(jié)果顯示，無血清組和含血清組ColⅡ、ColⅨ、ColⅩ、Aggrecan、Sox9和18S的表達(dá)均無明顯差異，其中標(biāo)志細(xì)胞肥大的ColⅩ均沒有表達(dá)。結(jié)果提示，軟骨細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下軟骨特異基因的表達(dá)并未減少（圖6）。

圖6 體外培養(yǎng)2周時兩組軟骨特異基因的表達(dá)Fig.6 The expression of specific genes of the chondrocyte pellets in serum-containing group and serum-free group 2 weeks after culture

3 討論

自體軟骨細(xì)胞是目前軟骨缺損治療及軟骨組織工程最常用的種子細(xì)胞，但其數(shù)量有限,需經(jīng)體外擴增才能獲得足量有功能的軟骨細(xì)胞用于軟骨組織的修復(fù)或重建[12]?，F(xiàn)有的擴增方法都是添加血清的單層培養(yǎng)，但是由于血清的成分十分復(fù)雜，在對細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行分析或者提純時必然受到血清成分的干擾；同時不同批號血清的質(zhì)量難以保持一致，所以無血清培養(yǎng)基用于軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)勢在必行。研究顯示添加特異生長因子的無血清培養(yǎng)基在細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞表達(dá)特異細(xì)胞外基質(zhì)方面與含血清培養(yǎng)效果相似[13-14]，如無血清培養(yǎng)基中添加高密度脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、成纖維生長因子、氫化可的松和表皮生長因子，可以顯著促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞增殖[15]。

本實驗應(yīng)用以ITS為主要成分，包括維生素C、地塞米松的無血清培養(yǎng)基，摒棄了常用的TGF-β1和IGF-1，與含血清培養(yǎng)基進(jìn)行了比較。我們希望的無血清培養(yǎng)基應(yīng)該滿足以下3方面的要求：①應(yīng)該能在三維培養(yǎng)的條件下保證軟骨細(xì)胞的存活；②能保持軟骨細(xì)胞的表型和分泌軟骨細(xì)胞特異的細(xì)胞外基質(zhì)；③在培養(yǎng)組織工程化軟骨時，能達(dá)到普通培養(yǎng)基的效果。研究顯示，兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞不能在未添加細(xì)胞因子和生長激素的F-12培養(yǎng)基中生存，1周內(nèi)細(xì)胞全部死亡[16]，而本實驗培養(yǎng)基中添加胰島素鐵硒傳遞蛋白（ITS）、地塞米松以及維生素C，雖然在平面培養(yǎng)的條件下不能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，但是尚能維持軟骨細(xì)胞體外生存1周。在含血清組，兩種最重要細(xì)胞外基質(zhì)蛋白蛋白多糖（Aggrecan）和Ⅱ型膠原（ColⅡ）的表達(dá)在1周的培養(yǎng)時間內(nèi)逐漸增強，而無血清組的表達(dá)則在培養(yǎng)第7天時明顯減弱，提示包含ITS、維生素C和地塞米松的無血清培養(yǎng)基方案在單層培養(yǎng)的條件下只能短期保持軟骨細(xì)胞的表型。

應(yīng)用包含ITS、維生素C和地塞米松的無血清培養(yǎng)基方案三維培養(yǎng)軟骨細(xì)胞pellets時，軟骨細(xì)胞聚集體在大體、濕重方面無血清組甚至優(yōu)于常規(guī)含10%血清的對照組；在軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)Aggrecan和ColⅡ的染色方面兩組無明顯差異；在軟骨特異基因ColⅡ、ColⅨ、ColⅩ、Aggrecan、Sox9和18S的表達(dá)方面兩組結(jié)果也無明顯差異。提示在三維培養(yǎng)的條件下，以ITS、地塞米松和維生素C為主要成分的無血清培養(yǎng)基可以保持軟骨細(xì)胞的表型、促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌特異細(xì)胞外基質(zhì)，培養(yǎng)組織工程化軟骨時能達(dá)到普通培養(yǎng)基的效果。

對軟骨細(xì)胞的生物學(xué)研究是軟骨組織工程中重要的基礎(chǔ)課題，在軟骨組織工程研究中應(yīng)用無血清培養(yǎng)基勢在必行，本研究結(jié)果對于應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的研究具有重要意義。

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Effects of Serum-free Culture M edium Containing ITS on Chondrocytes Proliferation and Phenotype

LIU Jinchun1,2,KANG Ning1,XIAO Ran1,LIU Xia1,CAO Yilin1.
1 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100144,China;2 Medical Lab of Tissue Regeneration,Xinxiang Medical College,Henan 453003,China. Corresponding author:LIU Xia(E-mail：lacey2003@163.com);CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com)

Objective To investigate the effects of serum-free culturemedium containing Insulin-Transferrin-Selenium on chondrocytes proliferation and phenotype.Methods P2 Chondrocytes were cultured in monolayer or in 3-D pellets in DMEM with 10%FBS(serum-containing group)and DMEM with 1%ITS,10-7 M Dexamethasone,50μg/m L Vitamin C (serum-free group).Chondrocytes proliferation,matrix secretion and gene expression were tested by MTT assay,histological staining,immunohistochemistry and semi-quantitative gene expression analysis.Results Serum-free culturemedium could not promote chondrocytes proliferation and phenotype of chondrocytes could be maintained for only 3 days in monolayer culture.In 3-D culture,the histological,immunohistochemical results and expression of cartilage-specific genes were comparable between serum-containing group and serum-free group.Conclusion Serum-free culturemedium could promote cartilage formation and maintain phenotype of chondrocytes in 3-D culture.Serum-free culture medium can be used for differential proteomics analysis and protein assay analysis.

Serum-freemedium;Insulin-Transferrin-Selenium;Tissue engineering;Chondrocytes phenotype

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）03－0121－05

2012年3月23日；

2012年5月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.001

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(30801192)；北京市自然科學(xué)基金（7102134）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（新教師基金課題，200800231078）；衛(wèi)生部臨床學(xué)科重點項目；北京市科委重大計劃項目（D090800046609003）。

100144北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心（劉瑾春，康寧，肖苒，劉霞，曹誼林）；453003河南省新鄉(xiāng)市新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室（劉瑾春）。

劉霞（E-mail：lacey2003@163.com）；曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。