顱縫早閉癥相關(guān)實驗熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇研究

楊嫻嫻 Jodie T Hatfield Susan J Hinze 穆雄錚 Peter J Anderson Barry C Powell

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）作為檢測基因 表達(dá)譜的高通量、高精度的方法，在生物學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用。采用穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)Ψ磻?yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可以增加該方法的敏感度、可重復(fù)性和動態(tài)范圍，理想的內(nèi)參基因在所研究的組織、細(xì)胞和實驗條件下均恒定表達(dá)。管家基因是維持細(xì)胞最低限度功能必不可少的基因，在所有類型細(xì)胞中都表達(dá)，是廣泛應(yīng)用的內(nèi)參基因，如β-actin（肌動蛋白）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、B2M（微球蛋白）及18S RNA等[1]。然而，很多研究表明，管家基因在不同組織、細(xì)胞以及不同條件下，表達(dá)量并非永遠(yuǎn)恒定，甚至差別很大，至今尚未發(fā)現(xiàn)在所有條件下均恒定表達(dá)的管家基因[2-4]。因此，對特定基因表達(dá)研究中候選管家基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價，篩選出最為穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參，對于保證研究結(jié)果的真實可靠至關(guān)重要。目前已有不少相關(guān)的統(tǒng)計分析軟件，如 geNorm、Norm Finder、Bestkeeper等用于內(nèi)參基因的篩選[2，5-6]。

目前，在顱骨成骨與顱縫閉合過程中基因表達(dá)的研究方面，RT-qPCR分析并未根據(jù)所研究組織細(xì)胞的種類或不同的實驗條件而選擇合適的內(nèi)參基因，多數(shù)仍簡單采用β-actin或GAPDH作為內(nèi)參。

本實驗選擇與顱骨成骨、顱縫閉合相關(guān)的常用的3組實驗標(biāo)本，分別為：Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織、顱縫早閉患者體外培養(yǎng)顱縫原代細(xì)胞和體外培養(yǎng)的小鼠Kusa 4b 10成骨細(xì)胞株，以常用的候選管家基因作為研究對象，利用geNorm軟件對RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行分析，以篩選出在不同組織細(xì)胞中表達(dá)最為穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RNase ZAP、DEPC、 青鏈霉素、Alizarin Red S、Tris（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Trizol、SuperScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、FBS、α-MEM 培養(yǎng)液、10 mM dNTPs（Invitrogen 公司，美國）；10× PCR Buffer、25 mM MgCl2、AmpliTaqGold DNA polymerase（Applied Biosystems公司，美國）；KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒 （Kapa Biosystems公司，美國）；geNormTM Housekeeping Gene Selection試劑盒（Primer Design公司，英國）；其余試劑均為分析純。

GeneAmp PCR System 9700基因擴(kuò)增儀（PE Applied Biosystems公司， 美國）；Rotor-Gene 6000 Real-Time PCR 儀（Corbett Reserach，Qiagen公司，德國）；高速臺式離心機(jī)5415D（Eppendorf公司，德國）；G:BOX凝膠成像分析儀（Syngene公司，英國）；NanoVue超微量分光光度計（GE公司，美國）；解剖顯微鏡（Motic公司，香港）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）。

1.2 實驗動物與細(xì)胞

Fgfr2cC342Y/+雄性小鼠 （美國華盛頓大學(xué)Chad Perlyn教授惠贈），Swiss雌性小鼠（購自阿德萊德婦女兒童醫(yī)院動物實驗中心）。

顱縫原代細(xì)胞取材來源于7名接受經(jīng)顱徑路顱縫早閉癥手術(shù)的患者，預(yù)先均按照規(guī)定簽署實驗研究知情同意書。

Kusa 4b 10細(xì)胞株為小鼠骨髓基質(zhì)來源的成骨前體細(xì)胞[7]（澳大利亞St.Vincent醫(yī)學(xué)研究所惠贈）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本取材與分組

1.3.1.1 Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織

Fgfr2cC342Y/+雄性小鼠與Swiss雌性小鼠配種繁殖。子代中將出現(xiàn)野生型（WT，+/+）或雜合子（Het，+/-）2種基因型。提取鼠尾組織抽提基因組DNA進(jìn)行基因型鑒定，并進(jìn)行鼠耳標(biāo)記。孕鼠經(jīng)剖宮獲取胎鼠，切取實驗用顱縫組織后，提取鼠尾組織進(jìn)行基因型鑒定。按“QIAGEN全血和組織DNA抽提試劑盒”進(jìn)行操作，PCR擴(kuò)增突變基因外顯子，引物序列為Forward：5'-CAAGCAAGCTCAACAG GAGAG-3'和 Reverse：5'-GCTGTGCTGCTGAGAGTTTTG-3'。 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)野生型出現(xiàn)224 bp條帶，雜合子出現(xiàn)290 bp突變等位基因條帶，確定基因型。

選擇胚胎第16.5天、18.5天以及出生后第0、1、5、10天的Fgfr2cC342Y/+小鼠，分別切取冠狀縫、后額縫、矢狀縫、人字縫復(fù)合組織和顱頂骨（顱縫復(fù)合組織包括顱縫間質(zhì)、成骨緣及其下硬腦膜，切取顱縫時盡可能留小于1 mm成骨緣），分管標(biāo)記置于5 mL EP管中，-80℃保存。選擇不同天數(shù)、不同基因型、不同個體來源、不同顱縫來源的組織標(biāo)本共18個（表1）。

1.3.1.2 顱縫早閉癥患者體外培養(yǎng)顱縫原代細(xì)胞

患者基因型分析檢驗是否存在FGFR1-3和Twist基因突變[8]。顱縫組織經(jīng)膠原酶消化、組織塊體外培養(yǎng)收集原代細(xì)胞[9]。選擇不同顱縫來源、正常或早閉顱縫、不同傳代數(shù)的細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行g(shù)eNorm研究（表 2）。

1.3.1.3 體外培養(yǎng)小鼠Kusa 4b 10成骨細(xì)胞株

細(xì)胞置于T75培養(yǎng)瓶，含10%熱滅活的FBS和100 IU/mL青、鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液，37℃恒溫混合氣體（5%CO2、95%O2）環(huán)境中培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況，每隔2～3 d換液一次。鏡下觀察，約80%生長融合時，細(xì)胞傳代。

成骨誘導(dǎo)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)為5000（傳代第20代）時，移至3板24孔培養(yǎng)皿，次日加入成骨誘導(dǎo)液（α-MEM，15%FBS，10 mM β-磷酸甘油，50 μg/mL抗壞血酸，100 IU/mL青、鏈霉素）培養(yǎng)，3 d換液一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，收集細(xì)胞進(jìn)行茜素紅（Alizarin Red S）鈣結(jié)節(jié)染色：細(xì)胞經(jīng)70%乙醇固定后，加入0.1%Alizarin Red S溶液染色10min，水洗，室溫下干燥，染色后細(xì)胞加入乙酸∶甲醇（1∶1）脫染色 30min，提取的染料由分光光度儀A450定量分析。分別收集誘導(dǎo)（誘導(dǎo)后 3 d、7 d、14 d和 21 d）與非誘導(dǎo)細(xì)胞（培養(yǎng) 0 d、3 d、7 d、14 d 和 21 d）進(jìn)行 geNorm 分析。

1.3.2 RNA抽提與逆轉(zhuǎn)錄

顱縫組織與細(xì)胞標(biāo)本按Trizol法抽提總RNA，加入糖原充分混勻共沉淀，應(yīng)用20μL DEPC蒸餾水55℃促溶10min獲得RNA標(biāo)本；胚胎顱縫標(biāo)本極小，將相同基因型、2只小鼠的同一顱縫來源標(biāo)本置于同一EP管中進(jìn)行抽提以增加RNA產(chǎn)量。A260/A280、1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA純度及濃度測定。

分別取500 ng Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織RNA、250 ng人顱縫細(xì)胞RNA和1 μg Kusa 4b 10細(xì)胞RNA，采用SuperScriptTMⅢFirst-Strand Synthesis System試劑盒20μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織cDNA經(jīng)不含RNase/DNase的高壓水1∶3比例稀釋，人顱縫細(xì)胞cDNA 1∶4稀釋，Kusa 4b 10細(xì)胞cDNA 1∶10稀釋。所有反應(yīng)均設(shè)定相應(yīng)No-RT陰性對照（即逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，由高壓水替代SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶）。

1.3.3 geNorm分析

針對不同的標(biāo)本類型，設(shè)計三組單獨的geNorm分析實驗，分別采用小鼠或人geNormTM Housekeeping Gene Selection試劑盒（提供候選內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增引物）。RT-qPCR反應(yīng)采用KAPA SYBR FAST qPCR Kit試劑盒，10μL qPCR 反應(yīng)體系包含5μL 2× Kapa Master Mix，0.5μL 基因特異性 20×引物，1.43μL cDNA 和 3.07μL 高壓水。 在 Rotor-Gene 6000 Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序按①95℃ 3min，②95℃ 3 sec，③60℃ 25 sec，回到步驟②，共40個循環(huán)。

每一個RNA標(biāo)本均設(shè)3復(fù)孔，每一板PCR反應(yīng)均設(shè)定空白對照（NTCs），反應(yīng)結(jié)束后通過熔解曲線分析、凝膠電泳以及測序等鑒定產(chǎn)物的特異性。采用geNorm V3.5軟件進(jìn)行候選管家基因穩(wěn)定性分析[2]。通過該軟件計算出每個管家基因的表達(dá)穩(wěn)定值M，以及每個管家基因的表達(dá)相對于其他每一個待測管家基因表達(dá)的變異平均值V。M值越小，代表基因表達(dá)越穩(wěn)定，M<0.5視為穩(wěn)定內(nèi)參基因的典型閾值[10]；V確定用作校準(zhǔn)的最佳管家基因數(shù)目，軟件建議V<0.15為選擇閾值[2]。

1.3.4 目的基因表達(dá)水平與所選內(nèi)參基因的相關(guān)性研究

Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織實驗中，選擇出生后第0、1、5、10天的野生型和突變型小鼠各6只，分別取材獲得冠狀縫標(biāo)本共48個，進(jìn)行RT-qPCR實驗，檢測成骨標(biāo)志骨鈣素（OC）和堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)水平。OC，F(xiàn)orward：5'-ACCTCACAGATGCCAA GCC-3'，Reverse：5'-ATCTGGGCTGGGGACTGAG-3'；ALP，F(xiàn)orward：5’-GGGACGAATCTCAGGGTACA-3'，Reverse：5'-AGTAACTGGGGTCTCTCTCTTT-3’。PCR反應(yīng)前行目的基因擴(kuò)增效率檢測，即標(biāo)準(zhǔn)曲線建立，擴(kuò)增效率應(yīng)滿足100%±5%要求。分別選擇geNorm分析所得的針對本類標(biāo)本①單個最穩(wěn)定管家基因，②最穩(wěn)定基因組合以及③最不穩(wěn)定基因進(jìn)行結(jié)果分析，采用qBasePLUS軟件[10]，可同時選多個內(nèi)參基因，并考慮每一反應(yīng)的擴(kuò)增效率進(jìn)行結(jié)果校對。

2 結(jié)果

2.1 候選管家基因選擇

geNormTM Housekeeping Gene Selection試劑盒針對小鼠或人不同種類，各提供12個管家基因作為候選內(nèi)參。兩種試劑盒中所含候選基因基本一致，僅小鼠試劑盒中Canx和Ubc基因（表3），在人試劑盒中替換為SF3A1和TOP1基因（表4）。

本實驗選擇與顱骨成骨、顱縫閉合相關(guān)的常用3組實驗標(biāo)本，分別為：①Crouzon綜合征Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織；②顱縫早閉癥患者體外培養(yǎng)顱縫原代細(xì)胞；③小鼠Kusa 4b 10成骨細(xì)胞株。經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色驗證細(xì)胞是否存在成骨礦化。結(jié)果顯示，細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后（14 d、21 d），與非誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞或第0天細(xì)胞相比，礦化顯著增加，P<0.05（圖 1）。

2.2 RNA與qPCR質(zhì)量控制

檢測實驗標(biāo)本RNA純度與濃度（表5）。嚴(yán)格選擇凝膠電泳中含清晰18S與28S核糖體兩條條帶的RNA標(biāo)本進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增效率均在100%±5%范圍內(nèi)。通過熔解曲線分析、凝膠電泳以及測序等鑒定產(chǎn)物的特異性。此外，通過閾值設(shè)定對每一標(biāo)本的3個副孔原始Ct值進(jìn)行挑選，排除SD>0.1標(biāo)本組；排除>10%基因組DNA污染的no-RT標(biāo)本。

2.3 geNorm程序分析結(jié)果

從http://medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm網(wǎng)站下載geNorm程序，對各個管家基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，從而選擇最合適的內(nèi)參。根據(jù)3組實驗標(biāo)本進(jìn)行g(shù)eNorm分析。

結(jié)果顯示，F(xiàn)gfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織，Cyc1-Gapdh-Canx為最佳組合，在分析數(shù)據(jù)時，推薦選取這3個管家基因Ct值的幾何平均值作為內(nèi)參來對目的基因表達(dá)進(jìn)行校正；顱縫早閉癥患者體外培養(yǎng)顱縫原代細(xì)胞，18S rRNA和ATP5B為最佳組合；體外培養(yǎng)的小鼠Kusa 4b 10成骨細(xì)胞株，18S rRNA和Canx為最佳組合（圖2、表6）。

2.4 選擇不同內(nèi)參基因?qū)δ康幕騌T-qPCR的結(jié)果影響顯著

骨鈣素（OC）由分化晚期的成骨細(xì)胞分泌，作為成熟成骨細(xì)胞的功能標(biāo)志物[11]；堿性磷酸酶（ALP）為成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志[12]。在Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織實驗中，隨顱骨發(fā)育、顱縫閉合，二者表達(dá)水平逐漸增加[13－14]。geNorm 分析結(jié)果顯示：Cyc1 或 Gapdh為最穩(wěn)定管家基因，18S rRNA為最不穩(wěn)定基因，Cyc1-Gapdh-Canx為軟件推薦的最穩(wěn)定基因組合。

表1 Fgfr2cC342Y/+小鼠顱縫組織geNorm分析標(biāo)本Table 1 RNA sample list of geNorm assay of mouse suture tissues

表2 顱縫早閉患者體外培養(yǎng)顱縫原代細(xì)胞geNorm分析標(biāo)本Table 2 RNA sample list of geNorm assay of human suture cells

表3 geNorm分析試劑盒候選管家基因（鼠）Table 3 geNormTM housekeeping gene selection kit candidates（Mouse）

分別選擇①Cyc1、②18S rRNA、③Cyc1-Gapdh-Canx組合作為內(nèi)參基因，對目的基因PCR結(jié)果進(jìn)行校對，分析出生后第0、1、5、10天OC和ALP的表達(dá)趨勢（圖3）。當(dāng)選擇Cyc1或Cyc1-Gapdh-Canx組合作為內(nèi)參時，OC的表達(dá)趨勢基本一致（圖3a、b）；相反，以18S rRNA進(jìn)行校對時，出生后第5天和第10天的OC表達(dá)水平與前二者相比約下降1/2（圖3c）。選擇單個最穩(wěn)定基因或組合時，出生后第10天的OC表達(dá)水平顯著增加，為出生后第0天的30倍，若選擇最不穩(wěn)定基因，則表達(dá)水平僅增加達(dá)10倍，反映出最不穩(wěn)定基因?qū)Y(jié)果統(tǒng)計的顯著影響（圖3g）。ALP表達(dá)水平表現(xiàn)出相似的影響趨勢（圖3d-f、h）：當(dāng)選擇 3 基因組合時，出生后第 0、1、10 天，突變型較野生型ALP表達(dá)顯著增加。當(dāng)選擇18S rRNA，ALP突變型與野生型僅出生后第0天存在顯著差異；選擇Cyc1，則二者無差異。

表4 geNorm分析試劑盒候選管家基因（人）Table 4 geNormTM housekeeping gene selection kit candidates(Human)

圖1 Kusa 4b 10細(xì)胞茜素紅礦化染色檢測Fig.1 Induction of mineralization in Kusa 4b 10 cells

表5 RNA質(zhì)量與產(chǎn)量Table 5 RNA quality and quantity

圖2 顱縫早閉癥相關(guān)實驗管家基因穩(wěn)定性geNorm分析Fig.2 Housekeeping gene stability in craniosynostosis-related mouse suture tissues and human suture cells and Kusa 4b 10 osteoblasts using geNorm analysis

表7 geNorm分析總結(jié)Table 7 Summary of geNorm results

3 討論

實時定量熒光PCR研究中內(nèi)參基因的選擇是一個極其重要的環(huán)節(jié)，內(nèi)參基因選擇是否恰當(dāng)將對分析結(jié)果帶來很大的影響。證據(jù)表明，若在任何情況下都不加選擇地使用單一的內(nèi)參基因，將會給實驗帶來很大的誤差。Vandesompele等[2]研究認(rèn)為，單獨使用一個內(nèi)參基因在25%的樣品中導(dǎo)致了3倍的表達(dá)誤差，在10%的樣品中誤差甚至達(dá)到6.4倍。因此，在利用定量PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析之前，首先要根據(jù)特定的實驗材料和實驗條件選擇合適的管家基因作為內(nèi)參基因，用于篩選最適管家基因的軟件相繼推出，如 geNorm、Norm Finder和 BestKeeper等[6，15]。

geNorm是一款用來從多個管家基因中選擇最適合特定實驗材料和反應(yīng)條件內(nèi)參基因的統(tǒng)計學(xué)分析軟件，該軟件能夠計算出每個管家基因的表達(dá)穩(wěn)定值M，以及每個管家基因的表達(dá)相對于其他每一個待測管家基因表達(dá)的變異平均值V。M值越低，管家基因的表達(dá)越穩(wěn)定。在有些情況下，由于實驗條件及實驗材料復(fù)雜，可能無法找出非常穩(wěn)定表達(dá)的單個管家基因，或因?qū)Ρ磉_(dá)定量的精確度要求很高，或因在檢測一些表達(dá)量變化不太顯著的目的基因時，使用單個管家基因不能符合實驗的要求，此時需要利用多個管家基因來共同作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正，以盡量減少校正過程中的誤差。同時使用2個或2個以上穩(wěn)定表達(dá)的管家基因，來對目的基因的表達(dá)進(jìn)行校正，已成為定量PCR研究中的一個新的準(zhǔn)則[10]。各管家基因的配對變異度V值可以指導(dǎo)內(nèi)參基因的數(shù)目選擇，Vandesompele等[2]建議，當(dāng)配對變異度V<0.15時，則無需加入更多的管家基因來進(jìn)行校正，如V2/3<0.15，表明只需選擇2個內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)。

在顱縫早閉癥基因表達(dá)的定量研究中，目前尚未選擇內(nèi)參基因，多數(shù)隨機(jī)選取傳統(tǒng)ACTB、GAPDH或18S rRNA作為內(nèi)參。本研究選取了3組代表性標(biāo)本，分別選擇不同種屬geNorm試劑盒來篩選合適的內(nèi)參基因。實驗組RNA取材應(yīng)盡量涵蓋各種不同類型的標(biāo)本，使選擇出的內(nèi)參基因更為符合實際實驗設(shè)計需求。例如：小鼠顱縫組織標(biāo)本選擇，包括不同類型顱縫、顱縫發(fā)育不同時期和不同基因型（野生型或突變型）標(biāo)本；人顱縫細(xì)胞標(biāo)本選擇包括來源于不同畸形患者的不同類型顱縫、不同傳代數(shù)細(xì)胞；Kusa 4b 10細(xì)胞株標(biāo)本選擇包括體外誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)成骨兩種條件下、不同誘導(dǎo)天數(shù)的培養(yǎng)細(xì)胞。

本實驗中Biogazelle公司開發(fā)的qbasePLUS分析軟件[10]基于傳統(tǒng)2-ΔΔCt原理，結(jié)合geNorm分析可設(shè)定多個管家基因，軟件自動將管家基因的幾何平均值作為內(nèi)參對目的基因進(jìn)行校對，同時結(jié)合每一次PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，獲得目的基因的最終相對定量，節(jié)省了計算時間，分析結(jié)果也更為精確。

有趣的是，雖然實驗選取的3組代表性標(biāo)本均與顱縫相關(guān)，但是每一個單獨geNorm分析所列出的內(nèi)參基因穩(wěn)定性列表卻完全不同，而且不同標(biāo)本GAPDH、ACTB和18S rRNA在穩(wěn)定性列表中的排名存在較大的差異。上述結(jié)果提示，在設(shè)計RT-qPCR實驗之前，應(yīng)針對所選擇的標(biāo)本類型與種類，進(jìn)行管家基因穩(wěn)定性分析。其他學(xué)科的PCR研究也驗證了這一觀點，即未經(jīng)過篩選的管家基因用于結(jié)果校對，缺乏可信度，將使實驗存在較大誤差[16-18]。

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