高原低氧環(huán)境對(duì)兔牙周炎模型血清和牙齦組織中超氧化物歧化酶活力的影響

武曦 黃鏡靜 張綱 譚穎徽 高鈺琪

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 口腔科；2.第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系，重慶400037）

氧自由基是機(jī)體代謝中的產(chǎn)物，生理情況下，其產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是機(jī)體對(duì)抗氧自由基的第一道防線，其活性直接影響機(jī)體內(nèi)氧自由基的清除。

研究[1-2]表明：在一定程度上牙周炎是自由基產(chǎn)生和清除失衡介導(dǎo)的組織損傷，牙周炎癥時(shí)，中性粒細(xì)胞通過(guò)呼吸暴發(fā)釋放過(guò)多的氧自由基，對(duì)周圍組織細(xì)胞產(chǎn)生破壞。高原低氧環(huán)境會(huì)增加機(jī)體的氧化壓力，改變組織細(xì)胞的代謝，從而造成各種生理病理反應(yīng)。流行病學(xué)調(diào)查[3]顯示高原地區(qū)牙周患病率顯著高于其他地區(qū)，且炎癥程度明顯加重，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立兔高原牙周炎模型，觀察其血清和牙齦組織中SOD活力水平的改變，以探討SOD和氧自由基在高原牙周病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器

中國(guó)大白兔（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），速眠新Ⅱ（獸用注射麻藥，吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司），牙菌斑顯示片（上海益口佳口腔護(hù)理用品有限公司），BCA試劑、SOD活力測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），Infinite M200多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司，澳大利亞），DU-800核酸蛋白檢測(cè)儀（Beckman公司，美國(guó)），低壓動(dòng)物艙（第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及飼養(yǎng) 健康雄性白兔40只，體重（1.9±0.2）kg，隨機(jī)分為4組，每組10只。其中，常氧對(duì)照組為普通飲食常氧常規(guī)飼養(yǎng)；常氧實(shí)驗(yàn)組建立牙周炎動(dòng)物模型，常氧常規(guī)飼養(yǎng)；低氧對(duì)照組為普通飲食低壓氧艙飼養(yǎng)；低氧實(shí)驗(yàn)組建立牙周炎動(dòng)物模型，低壓氧艙飼養(yǎng)。低氧實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物每天進(jìn)入模擬海拔5 000 m環(huán)境的低壓氧艙23 h。

1.2.2 牙周炎動(dòng)物模型的建立方法 將常氧實(shí)驗(yàn)組和低氧實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物用速眠新（0.1～0.2 mL·kg-1）經(jīng)肌肉注射麻醉，采用口腔正畸結(jié)扎絲（直徑0.25 mm）結(jié)扎雙下頜中切牙牙頸部一圈，結(jié)扎絲盡量靠近齦緣，以不損傷牙齦上皮為宜。定期對(duì)動(dòng)物口腔內(nèi)狀況復(fù)查，脫落或移位結(jié)扎絲重新結(jié)扎。按照Keyes’s diet 2000牙周炎食譜[4]喂養(yǎng)。

1.2.3 動(dòng)物體重檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)初始、2、4、6、8周清晨空腹時(shí)分別稱取動(dòng)物體重，按編號(hào)記錄。

1.2.4 血清和牙齦組織樣本采集 在實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，取動(dòng)物清晨空腹耳緣靜脈血標(biāo)本，4 ℃下靜置過(guò)夜，3 000 r·min-1、4 ℃低溫離心15 min取上層血清，分裝至無(wú)菌EP管中，登記編號(hào)，-70 ℃保存?zhèn)溆?。取各組動(dòng)物下頜中切牙周圍牙齦組織，4 ℃冰生理鹽水漂洗去除血液后，濾紙吸干，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 牙周各項(xiàng)臨床指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)8周后，檢查各組動(dòng)物下頜中切牙的牙周情況。1）牙齦指數(shù)（gingival index，GI）：用牙周探針檢測(cè)雙下頜中切牙，輕探至齦溝或牙周袋底，移出探針后停留1～2 s，觀察牙齦出血情況。2）牙菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）：用棉簽蘸取少量菌斑顯示液，輕輕地均勻涂于雙下頜中切牙牙面、齦緣及鄰間隙處，待1～2 min后觀察顯色情況，采用Loe和Slliness四分度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)分。3）附著喪失（attachment loss，AL）：探診記錄牙周袋深度后，探針沿牙面退出探尋釉牙骨質(zhì)界，記錄釉牙骨質(zhì)界到齦緣的距離，探診深度減去該距離即為附著喪失，每牙測(cè)近中、正中、遠(yuǎn)中3個(gè)位點(diǎn)，兩側(cè)牙共6個(gè)位點(diǎn)取均值。操作均由同一人完成。

1.2.6 血清和牙齦組織中總SOD（total-SOD，T-SOD）活力測(cè)定 血清：將血清復(fù)溫至室溫。牙齦組織：組織塊稱重后，冰浴速剪置入組織勻漿器中，加入適量冰生理鹽水，按組織塊重量∶鹽水體積為1∶9制備10%組織勻漿，3 000 r·min-1、4 ℃低溫離心15 min取上清，再用生理鹽水按體積比1∶9稀釋成1%的組織勻漿樣本，BCA法測(cè)定1%組織勻漿樣本中總蛋白含量，再按T-SOD活力測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)對(duì)上述血清和組織勻漿標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，使各組T-SOD抑制率為0.15～0.55，計(jì)算各個(gè)樣本中T-SOD的活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。等級(jí)資料GI、PLI采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料AL、T-SOD活力以±s表示，組間比較采用方差分析，低氧實(shí)驗(yàn)組AL、血清及牙齦組織中T-SOD活力的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 體重的動(dòng)態(tài)變化

各組兔體重的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，各組動(dòng)物體重在實(shí)驗(yàn)初始時(shí)無(wú)明顯差異，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，低氧組動(dòng)物較常氧組動(dòng)物體重增長(zhǎng)緩慢。8周時(shí)常氧實(shí)驗(yàn)組和低氧實(shí)驗(yàn)組體重較相應(yīng)對(duì)照組增長(zhǎng)速度快，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；低氧實(shí)驗(yàn)組與常氧實(shí)驗(yàn)組、低氧對(duì)照組與常氧對(duì)照組相比，體重也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

表1 各組兔體重的動(dòng)態(tài)變化Tab 1 The dynamic change of weights in every group kg

2.2 牙周臨床指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)8周時(shí)，常氧對(duì)照組牙周組織肉眼觀察無(wú)明顯變化，多數(shù)僅在齦緣區(qū)有少量菌斑，用探針可刮出；常氧實(shí)驗(yàn)組牙周組織有中度炎癥，牙齦紅腫光亮，可探及牙周袋，探診出血（+），多數(shù)齦緣或牙面可見(jiàn)中等量菌斑；低氧對(duì)照組牙周組織有輕度炎癥，牙齦輕度水腫，探診不出血，多數(shù)齦緣或牙面可見(jiàn)少量菌斑；低氧實(shí)驗(yàn)組牙周組織有嚴(yán)重炎癥，牙齦明顯紅腫退縮，可探及較深牙周袋，探診出血（+），有自發(fā)出血傾向，在齦緣和牙面可見(jiàn)大量食糜。

各組的PLI、GI結(jié)果見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)分析表明：低氧實(shí)驗(yàn)組的PLI、GI與低氧對(duì)照組和常氧實(shí)驗(yàn)組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；常氧實(shí)驗(yàn)組與常氧對(duì)照組、低氧對(duì)照組與低氧實(shí)驗(yàn)組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

表2 各組的PLI、 GI結(jié)果Tab 2 The results of PLI and GI in every group

常氧對(duì)照組、常氧實(shí)驗(yàn)組、低氧對(duì)照組、低氧實(shí)驗(yàn)組的AL分別為（0.36±0.11）、（2.57±0.23）、（1.30±0.15）、（3.81±0.29）mm。統(tǒng)計(jì)分析表明：常氧實(shí)驗(yàn)組、低氧對(duì)照組的AL與常氧對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；低氧實(shí)驗(yàn)組的AL與常氧實(shí)驗(yàn)組、低氧對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3 T-SOD活力

各組血清和牙齦組織中T-SOD活力的比較見(jiàn)表3。從表3可見(jiàn)，低氧實(shí)驗(yàn)組T-SOD活力較常氧實(shí)驗(yàn)組、低氧對(duì)照組顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；常氧實(shí)驗(yàn)組與常氧對(duì)照組比較，T-SOD活力也降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表3 各組血清和牙齦組織中T-SOD活力的比較Tab 3 Comparison of T-SOD activity in serum and gingival tissues in every group

2.4 低氧實(shí)驗(yàn)組AL、血清及牙齦組織中T-SOD活力的相關(guān)性

低氧實(shí)驗(yàn)組AL、血清及牙齦組織中T-SOD 活力的相關(guān)性見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)：血清及牙齦組織中TSOD活力與AL呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.980和-0.804，P＜0.01），血清與牙齦組織中T-SOD活力呈正相關(guān)（r=0.846，P＜0.01）。這表明，模擬高原條件下牙周炎模型中全身和局部的T-SOD活力均隨附著喪失的增加顯著降低，全身與局部的改變一致。

表4 低氧實(shí)驗(yàn)組AL、 血清及牙齦組織中T-SOD活力的相關(guān)系數(shù)Tab 4 Coefficient correlation among AL and activity of T-SOD in serum and gingival tissues in hypoxia periodontitis group

3 討論

高原特殊環(huán)境下，機(jī)體難以耐受低氧環(huán)境，生長(zhǎng)和代謝均受到影響，從而產(chǎn)生一系列不適癥狀。本實(shí)驗(yàn)中觀察到低氧組動(dòng)物生長(zhǎng)遲緩，在實(shí)驗(yàn)8周時(shí)，體重出現(xiàn)輕微下降，并顯著低于常氧組，這可能與低氧環(huán)境下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生少食倦怠等一系列不適癥狀有關(guān)。高原環(huán)境應(yīng)激因素增多，一方面使分解代謝增強(qiáng)，合成代謝減少，直接增加基礎(chǔ)代謝率，另一方面可以引起機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，影響攝食和代謝，從而影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。

與以往常用的大鼠磨牙牙周炎模型[5]不同，本研究采用正畸結(jié)扎兔雙下頜中切牙聯(lián)合牙周炎食譜的方法，實(shí)驗(yàn)8周后成功建立兔牙周炎動(dòng)物模型。此方法便于操作和實(shí)時(shí)觀察，同時(shí)局部未接種致病原、注射致炎細(xì)胞因子或全身應(yīng)用激素，使牙周炎致病的多因素局限化，能更有效地研究牙周炎發(fā)病過(guò)程中的免疫因素。

一些研究[6-7]表明，高原低氧環(huán)境對(duì)牙周炎的發(fā)生、發(fā)展有一定影響。在高海拔地區(qū)，缺氧會(huì)增加機(jī)體的氧化壓力，影響代謝平衡。生理情況下，氧自由基作為機(jī)體代謝的產(chǎn)物，產(chǎn)生和清除保持平衡，吞噬細(xì)胞在防御中產(chǎn)生的一定量氧自由基還具有殺菌作用；在感染、損傷等病理情況下，過(guò)多氧自由基堆積會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。牙周炎癥時(shí)，過(guò)多的超氧自由基不能被及時(shí)清除，對(duì)牙周組織產(chǎn)生損傷。氧自由基的損傷方式主要有以下兩種：一是使細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜上的糖和蛋白，改變細(xì)胞和血管通透性，從而影響細(xì)胞的代謝和功能，導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死[8]；二是作為間接細(xì)胞信使參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路[9-10]，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的合成與釋放，這些炎癥介質(zhì)又反過(guò)來(lái)增加氧自由基產(chǎn)生，從而放大炎癥反應(yīng)[10-12]，通過(guò)直接破壞牙周組織細(xì)胞和間接的免疫損傷導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生和發(fā)展。

機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)有SOD、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）[13]，其中SOD是目前發(fā)現(xiàn)的唯一以氧自由基為底物的酶，能使氧自由基歧化為H2O2，再由CAT和GSH-Px催化轉(zhuǎn)化為氧和水。SOD在機(jī)體氧化和抗氧化平衡中起關(guān)鍵作用，能直接清除氧自由基，保護(hù)組織和細(xì)胞免受損傷。高等動(dòng)物體內(nèi)含兩種SOD，即CuZn-SOD和Mn-SOD，因此T-SOD活力代表機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)氧化的應(yīng)激能力和清除氧自由基的能力，是反映機(jī)體抗氧化能力的標(biāo)志。SOD作為生物大分子，其活性受到多種因素影響，在感染、輻射、衰老等因素下，其合成和活力均下降，機(jī)體清除氧自由基的能力降低，使氧自由基在體內(nèi)大量堆積，造成組織損傷[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬高原環(huán)境建立兔牙周炎模型，發(fā)現(xiàn)低氧實(shí)驗(yàn)組兔血清和牙齦組織中T-SOD活力較其余各組明顯降低（P＜0.05），其活力與AL顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），且牙齦組織和血清中T-SOD活力呈正相關(guān)（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，與平原常氧環(huán)境相比，高原缺氧環(huán)境下出現(xiàn)牙周炎癥時(shí)，T-SOD活力都顯著降低，且其活力的改變?cè)诰植拷M織與全身一致，加之中性粒細(xì)胞的呼吸暴發(fā)，使機(jī)體氧自由基相對(duì)或絕對(duì)增多，這加重了高原環(huán)境下牙周組織的破壞，同時(shí)這也是加重其他高原病的可能原因。SOD廣泛存在于自然界，其活力可受多種方式調(diào)節(jié)，利用分子修飾和脂質(zhì)體制備的手段增強(qiáng)SOD活力或作為輔助添加劑[16]，能促進(jìn)局部組織清除過(guò)多有害物質(zhì)，這為高原環(huán)境下牙周炎的預(yù)防和治療提供了新的思路。

[1]Chapple IL,Matthews JB.The role of reactive oxygen and antioxidant species in periodontal tissue destruction[J].Periodontol 2000,2007,43:160-232.

[2]D’Aiuto F,Nibali L,Parkar M,et al.Oxidative stress,systemic inflammation,and severe periodontitis[J].J Dent Res,2010,89（11）:1241-1246.

[3]肖嫻,張綱,李焰,等.駐高原和平原官兵口腔健康狀況調(diào)查[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,28（1）:40-41.

Xiao Xian,Zhang Gang,Li Yan,et al.The research of oral health in soldiers in plateau and plain[J].J Preventive Medicine Chin People’s Liberation Army,2010,28（1）:40-41.

[4]吳世蓮,劉麗.牙周炎動(dòng)物模型的研究概況[J].口腔醫(yī)學(xué),2006,26（5）:385-387.

Wu Shilian,Liu Li.The overview of research on periodontitis animal models[J].Stomatology,2006,26（5）:385-387.

[5]王宏運(yùn),劉寧,胡耀文,等.高原低氧環(huán)境對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況的影響[J].西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2008,29（4）:289-291.

Wang Hongyun,Liu Ning,Hu Yaowen,et al.Growth and development of human body and nutrition status in the environment of plateau and hypoxia[J].Medical J National Defending Forces Northwest China,2008,29（4）:289-291.

[6]肖嫻,孔燕,張綱,等.模擬高原低氧環(huán)境下大鼠牙周炎致病菌多樣性的實(shí)驗(yàn)研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2009,19（9）:517-520.

Xiao Xian,Kong Yan,Zhang Gang,et al.The pathogenic bacteria diversity of rat periodontitis in imitative plateau environment:An experimental study[J].Chin J Conserv Dent,2009,19（9）:517-520.

[7]孔燕,肖嫻,張綱,等.模擬高原條件下大鼠齦溝液中TNF-α、PGE2、IL-8與牙周炎的相關(guān)性研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010,26（5）:602-604.

Kong Yan,Xiao Xian,Zhang Gang,et al.Relationship between inflammatory cytokines in gingival crevicular fluid and periodontal clinical status in periodontitis rat model when exposed to hypoxia at high altitude[J].J Pract Stomatol,2010,26（5）:602-604.

[8]Kulbacka J,Saczko J,Chwilkowska A.Oxidative stress in cells damage processes[J].Pol Merkur Lekarski,2009,27（157）:44-47.

[9]Morgan MJ,Liu ZG.Crosstalk of reactive oxygen species and NFκB signaling[J].Cell Res,2011,21（1）:103-115.

[10]Roebuck KA.Oxidant stress regulation of IL-8 and ICAM-1 gene expression:Differential activation and binding of the transcription factors AP-1 and NF-kappa B[J].Int J Mol Med,1999,4（3）:223-230.

[11]Morgan MJ,Liu ZG.Reactive oxygen species in TNF alpha-induced signaling and cell death[J].Mol Cells,2010,30（1）:1-12.

[12]Lu Y,Wahl LM.Oxidative stress augments the production of matrix metalloproteinase-1,cyclooxygenase-2,and prostaglandin E2 through enhancement of NF-kappa B activity in lipopolysaccharide-activated human primary monocytes[J].J Immunol,2005,175（8）:5423-5429.

[13]張海元,劉魯川.氧自由基與牙周炎關(guān)系研究進(jìn)展[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2009,19（1）:46-49.

Zhang Haiyuan,Liu Luchuan.Progress on the relationship between oxygen-derived free radical and periodontitis[J].Chin J Conserv Dent,2009,19（1）:46-49.

[14]Wei D,Zhang XL,Wang YZ,et al.Lipid peroxidation levels,total oxidant status and superoxide dismutase in serum,saliva and gingival crevicular fluid in chronic periodontitis patients before and after periodontal therapy[J].Aust Dent J,2010,55（1）:70-78.

[15]Poliakova VV,Raksha NH,Drahan LP,et al.Effect of riboxine on processes of lipid peroxidation and activity of antioxidant enzymes in thymocytes of rats with radiation injury[J].Ukr Biokhim Zh,2010,82（4）:48-52.

[16]Alvarado C,Alvarez P,Jiménez L,et al.Oxidative stress in leukocytes from young prematurely aging mice is reversed by supplementation with biscuits rich in antioxidants[J].Dev Comp Immunol,2006,30（12）:1168-1180.