成骨誘導劑對拔牙創(chuàng)愈合的影響

陳俊良 單春城 何蕓 夏德林

（1.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院 口腔科，重慶402160；2.瀘州醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，瀘州646000）

牙拔除后局部牙槽嵴缺乏牙齒的支持和功能性刺激而發(fā)生萎縮、吸收，給牙列修復和種植治療帶來了牙槽骨骨量不足的問題。學者們研究出多種預防牙槽嵴吸收的方法，但由于材料制取復雜、操作煩瑣、治療效果不穩(wěn)定、費用較高等原因未廣泛應用于臨床[1]。一定劑量和濃度的地塞米松（10-8mol·L-1）、維生素C（50 mg·L-1）和β-甘油磷酸鈉（10 mmol·L-1）組成的試劑能誘導骨髓間充質干細胞（bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向成骨細胞方向分化，促進新骨形成，被認為是經(jīng)典的成骨誘導劑，已廣泛地用于基礎和臨床醫(yī)學研究[2]。將其植入拔牙創(chuàng)后，能否誘導牙槽窩內(nèi)骨的形成，促進拔牙創(chuàng)愈合及防止牙槽骨吸收萎縮，目前尚未見報道。本實驗將載有地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉的成骨誘導劑的明膠海綿植入拔牙創(chuàng)內(nèi)，觀察牙槽窩內(nèi)新骨的形成及牙槽骨吸收萎縮情況，來尋找一種操作簡捷、價格適宜、便于臨床廣泛推廣的方法來促進拔牙創(chuàng)愈合，減少牙槽嵴的萎縮和吸收。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

3%戊巴比妥鈉、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉（Sigma公司，美國）。吸收性明膠海綿（金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，國藥準字H3-2024096），在無菌條件下將其剪成0.3 cm×0.3 cm×0.7 cm大小，與拔牙窩相仿，然后浸潤由地塞米松（10-8mol·L-1）、維生素C（50 mg·L-1）和β-甘油磷酸鈉（10 mmol·L-1）組成的成骨誘導劑。

1.2 實驗方法

選用健康雄性家兔50只，體重2.5～3.0 kg，由瀘州醫(yī)學院實驗動物科分籠飼養(yǎng)。動物稱重后，3%戊巴比妥鈉（劑量為30 mg·kg-1）耳緣靜脈注射麻醉，常規(guī)消毒、鋪巾，拔除雙側上頜第一前磨牙，采用同體對照，右側拔牙創(chuàng)內(nèi)填入載有成骨誘導劑的明膠海綿，作為實驗側；左側拔牙創(chuàng)內(nèi)填入空載明膠海綿，作為對照側。術后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素（劑量為每次80萬單位，每天2次）。術后前3 d半流質飲食后普通飼料喂養(yǎng)，以防植入物脫落。分別于術后第1、2、4、8、12周時隨機處死10只動物，取雙側牙槽骨標本，行大體觀察測量和X線片檢測后立即于10%中性甲醛中固定，脫鈣組織切片，備用。

1.3 影像學檢查

術后1、2、4、8、12周拍攝牙槽骨標本X線片，測量各組各時間段標本骨缺損區(qū)的新骨密度，骨密度（bone mineral density，BMD）值以單位象素的灰度值（mean grey value，MGV）表示。采用Kodak 2100口腔X射線機及RVG 6000數(shù)字成像系統(tǒng)（電壓60 kV，管電流7 mA，曝光時間為0．1 s），用平行投照法行數(shù)字牙片拍攝。采用Adobe Photoshop CS5軟件測量標本數(shù)字X線片牙槽窩對應處的灰度值，骨密度越高，越阻射，亮度越高，灰度值即越高，呈對應關系。

1.4 牙槽嵴高度吸收值的測量

測量12周時牙槽嵴高度吸收值，以第二前磨牙遠中和第三前磨牙遠中牙槽嵴頂連線為參考線，測出拔牙處最低點距離該線的垂直距離，即為牙槽嵴高度吸收值。具體方法為：用直尺表示出牙槽嵴頂連線，用帶標記的20號擴銼針標記出拔牙處最低點距牙槽嵴頂連線的距離，用游標卡尺測出具體數(shù)值，分別由3人進行測量，每人測3次，計算平均值。

1.5 脫鈣石蠟切片的制作和染色

各組標本置于10%中性甲醛中固定，經(jīng)10%硝酸脫鈣，系列脫水，常規(guī)石蠟包埋，近遠中方向切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，對拔牙創(chuàng)區(qū)骨密度和牙槽嵴高度吸收值的測量結果進行配對計量資料比較的t檢驗。

2 結果

2.1 骨密度的測量結果

實驗側和對照側骨密度的測量結果見表1。隨著時間的增長，兩側拔牙創(chuàng)區(qū)骨密度值均有不同程度的增強。術后1周，實驗側和對照側骨密度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術后2、4、8、12周，同一時間，實驗側的骨密度值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。術后第8周，實驗側可見清晰骨小梁影像，拔牙窩骨密度與周圍正常骨密度接近，新生骨與正常骨界限不明顯。對照側拔牙窩新生骨與正常骨界限明顯（圖1）。

表1 實驗側和對照側X線片灰度值比較Tab 1 Comparison of MGV between experiment side and control side n=10

圖1 術后第8周，實驗側（上）和對照側（下）的X線片觀察結果Fig 1 X-ray results of experiment side（up）and control group（down）in 8 weeks

2.2 牙槽嵴高度吸收值的測量結果

術后12周時，實驗側和對照側牙槽嵴高度吸收值分別為（1.43±0.08）、（1.87±0.09）mm，實驗側牙槽嵴高度吸收值小于對照側，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 組織學觀察結果

實驗側和對照側的組織學觀察結果見圖2、3。實驗側術后1周即可觀察到成骨細胞及成骨趨勢，2周時較明顯；而對照側2周時牙槽窩內(nèi)為大量的血細胞和炎細胞及部分成纖維細胞，為新鮮的肉芽組織。4周時，實驗側牙槽窩已完全為纖維組織所充填，可見成骨細胞增生活躍。大量骨細胞被埋入新形成的骨基質中，形成骨陷窩，部分區(qū)域已見近似板層狀的類骨質形成。對照側纖維組織成分增多，在結締組織中僅有點狀骨島形成，成骨現(xiàn)象較少。8周時，實驗側骨小梁明顯較對照側粗大成熟。12周時，實驗側牙槽窩已充滿了成熟的板狀新骨；對照側新生骨才趨向成熟，部分為板層狀骨。

圖2 實驗側的組織學觀察結果 HE×100Fig 2 The histology results of experiment side HE× 100

圖3 對照側的組織學觀察結果 HE×100Fig 3 The histology results of control group HE×100

3 討論

拔牙創(chuàng)愈合是一個動態(tài)的復雜過程，是機體骨組織的一種再生修復過程[3]。為了促進拔牙創(chuàng)愈合和新骨形成，筆者采用在拔牙窩中置入成骨誘導劑的方法，結果表明效果是明顯的，其機制可能與下列因素有關。1）地塞米松是最常用的成骨誘導因子，可誘導骨髓基質細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，胰島素樣生長因子-1和膠原mRNA的表達，刺激細胞外膠原基質的生物合成、鈣的沉積和礦化結節(jié)的形成[4]。但高濃度地塞米松（10-6mol·L-1）卻會激活細胞表面的糖皮質激素受體，使其向脂肪細胞分化，抑制BMSCs增殖，從而減少向成骨細胞分化。一般認為地塞米松濃度取10-8～10-10moL·L-1為宜[5]，本實驗采用的地塞米松濃度為10-8moL·L-1。在本實驗中，1周時實驗側即可見較多成骨細胞，而對照側未發(fā)現(xiàn)，應該與地塞米松的誘導成骨作用相關。2）維生素C能促進細胞合成膠原，形成鈣化，同時調(diào)節(jié)ALP活性。目前認為，ALP能夠水解有機磷酸酶，使局部磷酸鹽濃度升高，并可破壞鈣化抑制劑，從而啟動鈣化，促進成骨。維生素C與許多生長因子有協(xié)同作用，可增加其他生長因子對細胞的增殖效應[6]。3）β-甘油磷酸鈉可以為成骨細胞提供磷酸離子，促進生理性鈣鹽的沉積和鈣化。3種因子的共同作用，加速了成骨細胞的分化和增殖，促進拔牙創(chuàng)骨形成。

誘導成骨過程的順利完成，一般需要3個基本條件：骨誘導因子、靶細胞和良好的局部骨形成環(huán)境。拔牙創(chuàng)有著良好的骨形成生物學特性和成骨環(huán)境。拔牙創(chuàng)骨壁疏松多孔，血循環(huán)豐富，局部抗感染力強。此外，拔牙窩內(nèi)有較多對骨誘導作用敏感的靶細胞，它們是余留牙周膜中間充質細胞和經(jīng)血循環(huán)從周圍骨髓腔進入拔牙創(chuàng)的骨髓基質干細胞[3，7]。明膠海綿作為成骨誘導劑的載體，能很好地維持藥物的局部濃度。同時它能促進血液凝固，使血凝塊內(nèi)的活性物質和誘導劑不易散失；纖維蛋白網(wǎng)的存在能夠吸引拔牙創(chuàng)內(nèi)間充質細胞向缺損區(qū)遷移，使其與誘導劑充分接觸，而促進這些細胞的增殖和分化；其特殊的微孔結構能為未分化的間質細胞遷入和新生血管的長入提供良好支架[8]，增加了生長因子和靶細胞的作用面積，保證了骨組織的再生空間。本實驗結果顯示：載有成骨誘導劑的明膠海綿置入拔牙創(chuàng)2周后即有新骨生成，成骨細胞分化與增生較對照側明顯活躍，在數(shù)量和質量上明顯優(yōu)于對照側。整個過程中，實驗側拔牙創(chuàng)內(nèi)成骨現(xiàn)象較對照側早，成骨細胞分化和增殖更活躍，新骨形成更快。骨密度測量分析顯示：實驗側和對照側拔牙創(chuàng)區(qū)骨密度值隨時間的增長均有不同程度的增強，同一時間，實驗側的骨密度值高于對照側。說明在地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C組成的成骨誘導劑的作用下，加速了成骨細胞的分化和增殖，從而促進成骨。

新骨的快速形成能使拔牙創(chuàng)區(qū)骨質承受較大壓力而不發(fā)生變形，也可防止無牙區(qū)牙槽嵴因受壓時間過長所產(chǎn)生的牙槽骨吸收，從而起到防止牙槽骨高度降低的效果。本實驗標本測量結果顯示：實驗側牙槽嵴吸收明顯少于對照側，說明該材料可能有保持牙槽嵴形態(tài)的作用。

地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C作為經(jīng)典的成骨誘導劑，能誘導BMSCs向成骨細胞方向分化，促進新骨形成。將載有成骨誘導劑的明膠海綿植入拔牙窩，能促進拔牙創(chuàng)愈合，加速成骨和骨改建，減輕牙槽骨的吸收萎縮。其制取容易、操作簡單、費用低廉，易于臨床廣泛推廣。

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