楊梅果醋體外抗氧化活性的研究

謝思蕓 鐘瑞敏， 肖仔君 鄧澤元

（1.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047；2.韶關(guān)學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關(guān) 512005）

楊梅（Myrica rubra Bied.Et Zucc.）是原產(chǎn)于中國的亞熱帶水果之一，富含花色苷、黃酮等多酚類物質(zhì)。多酚類物質(zhì)存在于多種水果蔬菜中，具有良好的抗氧化［1，2］、抗菌［3］、抗突變［4－6］等作用。近年來，國內(nèi)外學者對楊梅果實及其枝葉等的有效成分進行了較深入的研究［7－9］，先后分離鑒定了矢車菊－3－葡萄糖苷、楊梅素、槲皮素、沒食子酸等活性成分，并指出其抗氧化能力與這些活性成分的濃度呈正相關(guān)。

果醋是利用水果及水果下腳料通過微生物發(fā)酵得到的一類新型飲品，多項研究［10－12］指出，因果醋發(fā)酵條件比較溫和，能夠有效保留果品中的營養(yǎng)成分和多酚類活性物質(zhì)，同時，微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了多種活性物質(zhì)，如琥珀酸等有機酸，這些物質(zhì)都具有一定的抗氧化能力。

楊梅果醋是楊梅果汁經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵后所得的酸性飲品。目前，對楊梅果醋的研究主要集中在發(fā)酵工藝、飲品調(diào)配和相關(guān)營養(yǎng)成分檢測等方面［13－15］。對其抗氧化能力的評價則較少涉及。本試驗主要探討不同釀造工藝及原料對體外抗氧化能力的影響，為以后楊梅果醋功能飲品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

楊梅果汁：廣東始興縣野生青蒂品種，始興綠而健食品有限公司；

楊梅果酒、楊梅果醋和蘋果醋：本實驗室自制；

酵母菌：安琪酵母公司；

惡臭醋酸桿菌（AS1.41）：廣東省菌種保藏中心；

高粱醋：2年陳釀產(chǎn)品，山西水塔醋業(yè)有限公司；

1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；

三氯乙酸、水楊酸鈉：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

三氯化鐵、鐵氰化鉀：分析純，天津市福晨化學試劑廠；

過氧化氫：分析純，天津市百世化工有限公司；

硫酸亞鐵：分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

臺式離心機：TGL－16C，上海安亭科學儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－S，6S，江蘇大地自動化儀器廠；

可見分光光度計：722N，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅果酒釀造工藝

楊梅果汁→酶解→調(diào)節(jié)糖度→巴氏滅菌→降溫接種（0.2%酵母菌，30 ℃）→攪拌發(fā)酵（24h）→靜置發(fā)酵至酒精度達6% （V／V）

1.3.2 楊梅果醋釀造工藝

楊梅果酒→巴氏滅菌→快速降溫→分別接種于10L 和50L含靈芝粒載體發(fā)酵罐（2%醋酸菌，30 ℃）→通氧攪拌恒溫發(fā)酵→以酸度不再變化為發(fā)酵終點→將醋液混合，調(diào)節(jié)酸度為4%

1.3.3 蘋果醋釀造工藝

（1）蘋果酒：清洗→打漿→酶解→過濾→蘋果汁。按楊梅果酒方法發(fā)酵成蘋果酒。

（2）蘋果醋：蘋果果酒→巴氏滅菌→快速降溫→分別接種于10L和50L 發(fā)酵罐（2%醋酸菌，30 ℃）→通氧攪拌恒溫發(fā)酵→以酸度不再變化為發(fā)酵終點→將醋液混合，調(diào)節(jié)酸度為4%。

1.3.4 樣品預(yù)處理 經(jīng)上述方法所得的樣品，再經(jīng)300目濾布過濾、離心后，上清液為試驗樣液，假定質(zhì)量分數(shù)100%為未稀釋樣液，試驗時用蒸餾水稀釋到所需質(zhì)量分數(shù)。

1.3.5 抗氧化活性的測定方法

（1）羥自由基（·OH）清除率：本體系利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，即H2O2與Fe2＋混合后產(chǎn)生·OH，當體系存在水楊酸，能有效俘獲·OH 并生成紅色產(chǎn)物，此物質(zhì)在510nm 處有最大吸收。根據(jù)文獻［16～18］，修改如下：依次向試管中加入0.5mL FeSO4溶液（0.15mol／L）、2mL水楊酸鈉溶液（2mmol／L）、2.5mL 蒸餾水和1 mL 不 同質(zhì)量分 數(shù)（6%，10%，14%，20%，30%，40%，50%，60%）的 樣 液，最后加入1 mL H2O2（6 mmol／L）啟 動 反 應(yīng)，37 ℃下 反 應(yīng)1h，離心取上清液，510nm 處測吸光度。按式（1）計算·OH清除率：

式中：

E—— 羥自由基清除率，%

A0—— 空白對照液的吸光度；

Ai—— 加入樣品后的吸光度；

Aj—— 樣品溶液的本底吸光度。

（2）DPPH 自由基清除率：根據(jù)文獻［19］、［20］，修改如下：準確移取5mL DPPH 溶液（6.0×10－5mol／L），加入0.6 mL不 同 質(zhì) 量 分 數(shù)（5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%）的樣液，混勻，黑暗中放置30min后，離心取上清液，517nm 處測吸光度。按式（2）計算DPPH 自由基的清除率：

式中：

E——DPPH 自由基清除率，%；

A0—— 蒸餾水加DPPH 溶液的吸光度；

Ai—— 樣液加DPPH 溶液的吸光度；

Aj—— 樣液加乙醇溶劑的吸光度。

（3）還原能力：參照文獻［21］，取1 mL 不同質(zhì)量分數(shù)（5%，10%，15%，20%，25%）的樣液，依次加入0.2mL PBS緩沖液（0.2mol／L，pH 6.6）和0.5mL K3Fe（CN）6（1%），混勻，50 ℃下水浴20min，取出，流水冷卻，再加入1mL 三氯乙酸（10%）終止反應(yīng)，3 000r／min下離心10min，取1.5mL上清液，加入0.2mL FeCl3（1%）和3.0mL蒸餾水，搖勻，靜置5min，于700nm 處測定吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 清除羥自由基（·OH）能力

2.1.1 楊梅果汁、果酒、果醋清除羥自由基（·OH）的能力

由圖1可知，楊梅果汁、果酒及果醋對羥自由基均具有良好的清除能力，在試驗濃度范圍內(nèi)，其清除能力隨濃度增加而增強。當體積分數(shù)低于14%時，楊梅果醋較楊梅果汁及果酒而言，清除能力較差，清除率約為30%。隨著試驗濃度增大至20%，楊梅果醋對羥自由基的清除率持續(xù)顯著上升，高達87.6%，而此時楊梅果汁及果酒清除率分別為92%和93.6%。隨著濃度增加，三者間的清除能力相當，當達到最大的試驗濃度（60%），楊梅果醋的清除率為96.7%，而楊梅果汁和果酒均達到98.6%。雖然在較低濃度時，楊梅果醋的清除效果僅為楊梅果汁的1／3，但當濃度上升至40%，二者清除率并無顯著差別，總體說來，楊梅果醋在經(jīng)過長時間發(fā)酵后，清除能力仍有較好的保留。

2.1.2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋清除羥自由基（·OH）的能力 由圖2可知，在相同的酸度下（6%），3種醋樣清除羥自由基的能力因原料及發(fā)酵工藝不同而有明顯差異，隨著體積分數(shù)增加，其清除能力相應(yīng)增強，呈濃度效應(yīng)。在體系濃度低于14% 時，以高粱醋的清除效果最佳，清除率為65.1%，蘋果醋則最差，清除率僅有15.5%，而楊梅醋清除效果居中，清除率為30%。當濃度達30%以上，楊梅醋清除效率明顯提高，與高粱醋相當，當達到最大試驗濃度時，清除率分別高達96.7%和97.1%。相比較，蘋果醋的清除能力較差，隨濃度增加，清除效果變化不大，最高為43.3%，清除能力僅為楊梅醋的一半。說明楊梅果醋對羥自由基的清除率明顯優(yōu)于蘋果醋，原因可能在于多酚類成分等具備抗氧化能力的物質(zhì)在二者間的含量不同，而且在果醋釀造過程中，固定化發(fā)酵的方式與游離細胞發(fā)酵的方法相比，前者能有效縮短發(fā)酵時間，有利于此類物質(zhì)的保留。

圖1 楊梅果汁、果酒、果醋對羥自由基的清除作用Figure 1 Scavenging effects among bayberry juice，wine and vinegar on hydroxyl free radicals

圖2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋對羥自由基的清除作用Figure 2 Scavenging effects among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar on hydroxyl free radicals

2.2 清除DPPH 自由基能力

2.2.1 楊梅果汁、果酒、果醋清除DPPH 自由基的能力

DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的、以氮為中心的自由基，如果受試物能將其清除，則意味著受試物具有降低烷自由基或過氧化自由基的能力，同時能打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。由圖3可知，3種樣液對DPPH 自由基都具有良好的清除作用，隨著樣液濃度增加，清除效果顯著增強。其中，楊梅汁和楊梅酒清除能力相當，二者在10%的體積分數(shù)下，清除率均超過50%，當體積分數(shù)達35%時，隨著濃度增加，兩者對DPPH 的清除能力趨于穩(wěn)定，楊梅酒對DPPH 自由基清除率達100%，而楊梅汁的清除率也達85.3%。相比之下，楊梅醋的清除效果較好，圖中曲線相對平緩，隨著濃度增加，其DPPH 清除能力也逐步增強，在最大試驗濃度時清除率為80.2%，清除效果與楊梅汁相當。

2.2.2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋清除DPPH 自由基的能力

圖3 楊梅果汁、果酒、果醋對DPPH 自由基的清除作用Figure 3 Scavenging effects among bayberry juice，wine and vinegar on DPPH·

圖4 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋對DPPH 自由基的清除作用Figure 4 Scavenging effects among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar on DPPH·

由圖4可知，3種醋樣對DPPH 自由基清除能力具有顯著的差異。在最低濃度下（5%），高粱醋的清除效果很好，清除率接近90%，而楊梅醋的清除率為18.7%，蘋果醋則小于6%。隨著濃度增加，楊梅醋的清除率明顯增強，而高粱醋和蘋果醋則變化不大。當達到最高濃度（50%），高粱醋清除率達98.7%，楊梅醋為85.3%，相比較而言，蘋果醋對DPPH自由基幾乎沒有清除作用，即使在最大濃度下，其清除率約為11%，僅為高粱醋的1／9，楊梅醋的1／8。

2.3 還原能力

2.3.1 楊梅果汁、果酒、果醋的還原能力 一般而言，當一種物質(zhì)具有較強的還原能力，相應(yīng)的也具有較強的抗氧化能力。根據(jù)1.3.5（3）中的方法，若樣液在700nm 處吸光值越大，則其將Fe3＋轉(zhuǎn)化Fe2＋的量及生成的普魯士藍的量越多，表明其還原能力越強，即抗氧化能力越好。由圖5可知，3種樣液都具有較好的還原能力。其中，楊梅汁的還原能力最大，楊梅酒次之，楊梅醋最低。

2.3.2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋的還原能力 由圖6 可知，楊梅醋和高粱醋的還原能力相當。高粱醋的還原能力隨著樣液濃度增大而不斷增強，體積分數(shù)達20%時，其還原力趨于穩(wěn)定，而楊梅醋則仍處于顯著上升趨勢。而蘋果醋還原能力明顯低于其它兩種醋樣。

圖5 楊梅果汁、果酒、果醋還原能力測定Figure 5 Reducing capacity among bayberry juice，wine and vinegar

圖6 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋還原能力測定Figure 6 Reducing capacity among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar

綜上所述，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸好氧發(fā)酵制備的楊梅果醋，與楊梅果汁相比雖然其抗氧化能力有所下降，但仍然具備比較理想的抗氧化活性。果醋所經(jīng)歷的二次發(fā)酵會造成楊梅多酚類物質(zhì)的損失，尤其是醋酸發(fā)酵過程中的持續(xù)供氧易造成抗氧活性物質(zhì)的化學性氧化而損失部分抗氧化能力。由于固定化發(fā)酵時間相對較短，可減少因好氧發(fā)酵供氧造成的抗氧化物質(zhì)的損失，因此固定化發(fā)酵制備的果醋抗氧化能力遠遠大于游離細胞發(fā)酵的果醋。本試驗選取的市售高粱醋對照樣品抗氧化活性最強（該產(chǎn)品以富含多酚類抗氧化物質(zhì)的高粱、豌豆為主要原料釀造），這也說明中國北方地區(qū)生產(chǎn)的一些以高粱為主料的食醋擁有良好的保健價值。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，采用固定化細胞發(fā)酵的楊梅原醋含量達30%以上配制的楊梅果醋飲料仍然表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。楊梅果醋飲料中的原醋比例為35%～50%時，具有較好的酸感和風味。因此，采用楊梅果醋不僅可調(diào)配風味適宜的果醋飲料，同時還擁有良好的抗氧化活性，具有開發(fā)應(yīng)用價值。

后續(xù)研究擬通過在果酒和果醋發(fā)酵過程中添加具有抗氧化能力的物質(zhì)來保護原汁中的有效成分，或通過淺度發(fā)酵果酒并制備醋酸含量相對較低的楊梅果醋來縮短發(fā)酵時間以保護楊梅汁中多酚類成分，使楊梅果醋抗氧活性進一步提高。

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