真菌多糖定量檢測方法研究進(jìn)展

趙 艷 畢榮宇 牟德華

（河北科技大學(xué)，河北 石家莊 050018）

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中提取出來的，由10個以上單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物［1］。具有抗感染、抗輻射、降血糖、治療腫瘤等多種生物活性，被稱 為“生 物 應(yīng) 答 效 應(yīng) 物”（biological response modifier，BRM）［2］。目前，真菌多糖已成為食品科學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，而多糖的定量分析檢測是這些研究的基礎(chǔ)。隨著分析檢測技術(shù)的發(fā)展，多糖的檢測技術(shù)呈現(xiàn)多元化，正朝著便捷、精確的方向發(fā)展。多糖定量檢測方法包括比色法、色譜法、分子光譜法等［3－5］。

傳統(tǒng)測定多糖含量的方法是比色法，該方法的基礎(chǔ)是使多糖降解后與特定物質(zhì)發(fā)生顯色反應(yīng)，在最大吸收波長下測定吸光值，進(jìn)行定量測定。這種方法操作簡便，易于實(shí)現(xiàn)。常用的比色法是苯酚－硫酸法，該方法穩(wěn)定性良好、重現(xiàn)性高，是一種精確的測定多糖含量的方法。色譜法測定多糖含量包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）等［3］，這些方法主要用于組成多糖的單糖定量、定性分析，其應(yīng)用使得多糖的結(jié)構(gòu)分析、性能研究有了進(jìn)一步發(fā)展。

應(yīng)用以上方法需要對多糖進(jìn)行復(fù)雜的處理，如：多糖的降解、單糖的衍生化；同時對色譜柱、檢測器等要求較高，如果只是簡單的定量分析，可以選用快速、操作簡單的方法，如：剛果紅檢測法［6］、共振光散射法［7］。剛果紅是一種染料，其可與β－葡聚糖發(fā)生特異性結(jié)合，使待測溶液的最大吸收峰發(fā)生紅移，然后再根據(jù)吸光值和不同濃度多糖溶液的線性關(guān)系進(jìn)行定量分析。多糖屬于大分子物質(zhì)，有機(jī)染料在多糖表面發(fā)生堆積時可導(dǎo)致體系共振光散射信號的增強(qiáng)，通過增強(qiáng)的信號可對多糖進(jìn)行含量測定。

1 比色法

比色法是一種傳統(tǒng)的測定多糖含量的方法，其基本原理是［8］：用硫酸或鹽酸處理多糖，使多糖在強(qiáng)酸中脫水生成糠醛或其衍生物，然后利用紫外－可見分光光度計(jì)測定反應(yīng)溶液的吸光值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行多糖的定量測定。常用的比色法有苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法、地衣酚－硫酸法等。

其中苯酚－硫酸法是應(yīng)用最為廣泛的一種方法，苯酚硫酸法的具體原理為［9］多糖和寡糖被濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫水解成單糖，單糖在強(qiáng)酸條件下又與體系中的苯酚發(fā)生顯色反應(yīng)，生成橙色衍生物，該衍生物在波長490nm 處具有最大吸收峰。在一定范圍內(nèi)，吸收值與糖濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，因此可以進(jìn)行定量測定。精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)等都表明苯酚－硫酸法是一種使用性廣、精確度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好的測定真菌多糖的方法［10－12］。

孫國琴等［12］對苯酚－硫酸法測定杏鮑菇多糖進(jìn)行了研究，并對該方法的測定波長、顯色溫度、顯色時間、苯酚用量進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化之后加樣回收率達(dá)到99.16%，RSD 為1.16%。顯色液在120min內(nèi)穩(wěn)定，說明這種方法精確度高、穩(wěn)定性好。

何新益等［13］采用改良的苯酚－硫酸法測定了苦瓜提取物中的多糖含量，該方法以混合單糖代替葡萄糖作為對照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，消除了單一以葡萄糖為對照造成的系統(tǒng)誤差。結(jié)果表明，糖濃度在20～100μg范圍內(nèi)該方法線性關(guān)系良好；該法的平均回收率達(dá)100.68%，其供試液在2h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

多數(shù)情況下采用苯酚－硫酸法時，一般都用紫外－可見分光光度計(jì)，當(dāng)樣品數(shù)目較多時，操作就很繁瑣，同時由于儀器不穩(wěn)定帶來的誤差就無法避免。近年來，有學(xué)者開始使用酶標(biāo)儀進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)的測定［14－17］，該儀器可以同時處理十幾甚至幾十個樣品，具有快速、便捷、精確度高等優(yōu)點(diǎn)。楊定清等［14］使用多功能酶標(biāo)儀代替紫外－可見分光光度計(jì)對香菇總糖含量進(jìn)行了測定，研究表明該方法可以實(shí)現(xiàn)對樣品的快速測定，所需試樣量小，是一種理想的測定香菇中總糖含量的方法。

2 色譜法

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法測定糖類始于1958年，該方法具有選擇性強(qiáng)、分辨力好、靈敏度高以及分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，近年來，因毛細(xì)管色譜柱和程序升溫技術(shù)的普遍使用，糖類的氣相色譜測定方法得到更廣泛的應(yīng)用［8］。另外，氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用可以得到有關(guān)單糖殘基類型、鍵連接方式、糖的序列、糖環(huán)的形式、聚合度等多種結(jié)構(gòu)信息［18］。

糖類物質(zhì)本身沒有足夠的揮發(fā)性，在進(jìn)行氣相檢測時，必須先對其進(jìn)行衍生化，使其轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)、對熱穩(wěn)定的衍生物，再進(jìn)行檢測。目前常用的衍生物有三甲基硅烷化衍生物、三氟醋酸酯衍生物、糖醇醋酸酯衍生物、糖肟和糖腈衍生物［8，19，20］。在某些衍生物制備過程中，會生成衍生物的異構(gòu)體，在進(jìn)行氣相檢測時會生成干擾峰，因此在進(jìn)行衍生化時，應(yīng)根據(jù)具體的物質(zhì)，選擇合適的衍生物制備方法，使每種單糖分離出單一的色譜峰。

高庚申等［19］采用預(yù)衍生化－毛細(xì)管柱氣相色譜法對單糖進(jìn)行了測定，并對5種毛細(xì)管柱和3種衍生化方法進(jìn)行了綜合比較，選出了2種分離效果較好的毛細(xì)管柱，同時發(fā)現(xiàn)糖腈乙?；磻?yīng)操作簡便，避免了由于生成異構(gòu)體和歧化反應(yīng)出現(xiàn)的多峰現(xiàn)象，這種衍生化方法更適合單糖的氣相色譜定量分析。應(yīng)用該方法測定了7種單糖，其分析響應(yīng)信號與濃度均保持一定的線性關(guān)系。

李小定等［21］將提取純化的4 種灰樹花多糖級分用2mol／L的三氟乙酸在110 ℃下水解2h，然后將降解成的單糖制成乙酰酯生物，再選用毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行單糖的分離，測出了4種多糖級分的單糖組成，回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示平均回收率在98.5%～101.6%，表明該方法有較高的回收率，方法穩(wěn)定性良好。

朱彩平等［22］對提取的枸杞多糖進(jìn)行了水解、單糖糖腈乙酰化處理，然后進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果表明，枸杞多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖組成，其 含 量 分 別 為5.59%，45.57%，4.07%，1.85%，7.83%，35.07%。

2.2 液相色譜法

2.2.1 可見光檢測法 糖類物質(zhì)不具有紫外吸收，較早期選用液相法檢測糖類物質(zhì)時，需配備特定的檢測器，最常用的是示差檢測器，這種方法無需對糖類物質(zhì)進(jìn)行衍生化，相對來說比較簡單［20］。謝明勇等［23］選擇示差折光檢測器，以蒸餾水為流動相，用高效液相色譜法對茶葉多糖的含量進(jìn)行了測定。研究過程中他們以自制的茶葉多糖純品作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此為基礎(chǔ)對多種茶葉中多糖的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明該方法簡單、準(zhǔn)確、可靠，適合于作為茶葉多糖原材料和產(chǎn)品質(zhì)量控制的方法。韓振泰等［24］選用專用的糖分析柱，以分子量為104的葡聚糖為標(biāo)品，使用示差折光檢測器，對靈芝多糖的含量進(jìn)行了測定，方法回收率為98%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%，表明該方法是一種準(zhǔn)確性好、精密度高的測定靈芝多糖的方法。

除了示差檢測器外，還有學(xué)者選用普通的紫外－可見分光光度計(jì)進(jìn)行多糖含量的測定。木海鷗等［25］將提取自人參渣的多糖進(jìn)行水解，然后選擇紫外－可見分光光度計(jì)對其含量進(jìn)行了液相檢測。在進(jìn)行定量檢測時，選擇D－無水葡萄糖作為對照品，先對該單糖在紫外區(qū)的最大吸收波長和出峰時間進(jìn)行了確定，然后對人參多糖水解后的單糖進(jìn)行了測定。試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.5～10.0 mg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)也說明該法可靠、靈敏度高，可用于人參渣中多糖含量的測定。

2.2.2 紫外衍生法 雖然選用示差折光檢測器對多糖進(jìn)行液相檢測操作比較簡單，但示差檢測器靈敏度低、易受流速、壓力和組分改變的影響［8，19］。近年來出現(xiàn)了一種新的方法——衍生法，其原理是利用衍生化試劑處理多糖，使其變成具有對紫外或熒光敏感的衍生物，進(jìn)而使用常用的紫外－可見分光光度計(jì)或者熒光檢測器進(jìn)行檢測。該法又分為柱前衍生和柱后衍生兩種，常用的是柱前衍生法，即：分離前預(yù)先將樣品轉(zhuǎn)化為衍生物，然后進(jìn)行分離、檢測。常用的糖類紫外衍生化試劑有：2，4－二硝基苯、對甲氧基苯胺、2－氨基吡啶、6－氨基喹啉、苯甲酸、對氨基苯甲酸乙酯、吡唑啉酮，其中最常用的是吡唑啉酮試劑；常用的熒光檢測衍生試劑有［20］：3－（4－羧基苯甲?；?喹啉羧基醛（CBQCA）、2－氨基吖啶（2－AA）、8－氨基萘－1，3，6－三磺酸（ANTS），1－氨基芘－3，6，8－三磺酸（APTS）等。

目前多糖測定常用的方法是：選用1－苯基－3甲基－5吡唑啉酮（PMP）作為衍生試劑，對多糖進(jìn)行柱前衍生，然后進(jìn)行液相紫外檢測，研究表明這種方法可以快速、有效地分離單糖組分，這種方法精確度高、穩(wěn)定性良好、重現(xiàn)性好［26－30］。楊興斌等［26］采用PMP 對10 種標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行衍生化，在40min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了10種單糖的分離，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，其可重復(fù)性范圍為94.6%～108.0%，相對偏差低于4.9%，該方法適用于絞股藍(lán)茶多糖的分離鑒定，同時，研究過程中用三乙胺作為流動相改良劑，分離效果明顯提高。戴軍等［27］采用柱前衍生高效液相色譜法對杜氏鹽藻多糖的單糖組成進(jìn)行了測定，他們對衍生化條件和水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時對液相條件（乙腈的百分含量，磷酸鹽的pH 值）進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明這種柱前衍生法對于單糖的檢測有較高的準(zhǔn)確度，杜氏巖藻多糖主要是由葡萄糖和半乳糖組成的。

2.3 高效薄層色譜法

傳統(tǒng)的薄層色譜法是將樣品點(diǎn)到平板上，用展開劑進(jìn)行展開，然后用顯色劑進(jìn)行顯色，將顯色后的斑點(diǎn)與已知標(biāo)品進(jìn)行比較定性分析，將斑點(diǎn)洗脫下來后進(jìn)行掃描等處理可進(jìn)行定量分析?，F(xiàn)在，所說的薄層色譜法是指高效薄層色譜法，隨著薄層色譜掃描儀的出現(xiàn)，薄層色譜法變得越來越快捷、方便。

Eliza Malinowska等［31］采用薄層色譜法對猴頭菇多糖進(jìn)行了測定，研究過程中使用一次性微型定量吸管吸取3μL的樣品在硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，然后用苔黑酚－硫酸進(jìn)行原位乙?；?，顯色之后用雙波長進(jìn)行掃描檢測，與傳統(tǒng)的顯色方法相比，這種方法的線性范圍更為廣泛，也更加靈敏和迅速。

鄧國棟等［32］采用雙波長薄層色譜掃描法測定了茶多糖的單糖組成，使用硫酸將茶多糖進(jìn)行水解，水解后的單糖再進(jìn)行層析，然后利用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，將水解的單糖與幾種標(biāo)準(zhǔn)品比對進(jìn)行定性，采用外標(biāo)法進(jìn)行量的測定，該方法對阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的線性范圍為1 200～7 200μg；4種單糖的回收率分別為97.6%，98.5%，98.1%，95.9%，說明這種方法具有良好的準(zhǔn)確性。

萬仁玲等［33］建立了一種控制黃芪多糖粗粉質(zhì)量的方法，用苯酚－硫酸法測定黃芪多糖粉中總糖的含量，用薄層色譜半定量法測定黃芪多糖粗粉中低聚糖的含量，專屬性驗(yàn)證表明，應(yīng)用此法對葡萄糖和蔗糖進(jìn)行鑒別時，不會受多糖類和皂苷類物質(zhì)的干擾，同時，穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率結(jié)果也表明該方法有良好的準(zhǔn)確性，可作為檢測黃芪多糖粗粉質(zhì)量的有效方法。

以上幾種方法都屬于多糖定量測定的間接方法，都是在多糖降解為單糖之后進(jìn)行測定的。下面介紹幾種利用多糖和相關(guān)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，然后進(jìn)行定量測定的直接檢測方法。

3 剛果紅檢測法

剛果紅檢測法特別適用于具有β－三股螺旋結(jié)構(gòu)的葡聚糖的定量測定。剛果紅是一種染料，β－葡聚糖與剛果紅發(fā)生特異性結(jié)合時會導(dǎo)致剛果紅的最大吸收峰發(fā)生紅移，即向長波長方向移動，且多糖濃度在一定范圍內(nèi)時，剛果紅熒光吸收值的增加與多糖濃度的增加成線性關(guān)系，據(jù)此可以對β－葡聚糖進(jìn)行定量測定［6，34］。Helga Moleken等［6］使用此方法測定了β－葡聚糖的含量，研究過程中對剛果紅的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)剛果紅的濃度為0.08%時，這種方法有較高的靈敏度。杜先鋒等［35］采用剛果紅法測定了燕麥中β－葡聚糖的含量，同時研究了pH 值、時間、溫度、雜質(zhì)等因素對測定結(jié)果的影響，確定了最佳反應(yīng)pH 值、時間和溫度，并且添加的一些雜質(zhì)如可溶性淀粉、酪蛋白等對測定結(jié)果均無影響，說明剛果紅與β－葡聚糖有較高的專一性結(jié)合。

4 共振光散射法

共振光散射技術(shù)的原理是［36］：有機(jī)染料在蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子上進(jìn)行堆積導(dǎo)致強(qiáng)烈的共振光散射增強(qiáng)，信號的增強(qiáng)與生物大分子濃度具有線性關(guān)系，據(jù)此可進(jìn)行物質(zhì)的定量分析，這種技術(shù)使用普通的熒光分光光度計(jì)即可，具有便于操作的優(yōu)勢［30］。多糖分子屬于天然的大分子物質(zhì)，也可以采用共振光散射法這一新穎的測定技術(shù)。王元鳳等［7］利用共振光散射法對茶多糖的含量進(jìn)行了測定，研究表明向氯化十六烷基吡啶－氫氧化鈉（CPC－NaOH）體系中添加茶多糖TPS時，體系的共振光信號明顯增強(qiáng)。TPS的濃度為2.0～20.0μg／mL時，共振光信號的增強(qiáng)與多糖的濃度呈線性關(guān)系，這種方法便于操作，且具有較高的選擇性和穩(wěn)定性，具有明顯的優(yōu)勢。

從以上介紹的幾種方法可以看出，對于真菌多糖的定量測定，這些方法各有各的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的比色法操作簡便，可實(shí)現(xiàn)多糖含量的快速測定。氣相色譜、高效液相色譜法，需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的衍生處理，操作相對繁瑣，但這些方法可實(shí)現(xiàn)多糖的單糖組成測定、結(jié)構(gòu)分析等復(fù)雜研究。剛果紅檢測法和共振光散射法則是利用多糖屬于大分子這一特性，實(shí)現(xiàn)對其定量檢測。同時，這些方法具有一定的針對性，如：剛果紅染料專一地與具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖分子發(fā)生結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)具有該結(jié)構(gòu)的多糖分子的檢測。

多糖作為一種大分子物質(zhì)，其生物活性與其含量、分子結(jié)構(gòu)、單糖組成等有密切關(guān)系［37］。這些結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究，即構(gòu)效關(guān)系研究，都是以文章提到的這些方法為基礎(chǔ)的，隨著技術(shù)的發(fā)展，多糖的定量測定方法日趨多元化，為研究人員提供了更多的選擇余地，同時先進(jìn)儀器設(shè)備的推出，使得操作越來越簡便，結(jié)果越來越精確，為多糖的進(jìn)一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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