白木通籽分離蛋白酶法改性及功能性質(zhì)研究

史 卿 杜研學(xué) 熊 華 趙 強 胡居吾 鐘紅蘭 阮 霞

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

白 木 通（Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.var.australis（Diels）Rehd）屬木通科木通屬植物。據(jù)《中國藥典》2005版一部記載，其干燥莖藤入藥可作木通用，味苦，性寒，具利尿，活血通脈，抗菌消炎之功效［1］。江西省科技人員通過采集白木通野生藤，經(jīng)過多年馴化種植，已經(jīng)培育出高產(chǎn)油、高結(jié)果率的新白木通果，平均產(chǎn)量可達22.5t／hm2，最高產(chǎn)量可達45t／hm2。通過對白木通籽和果皮基本組成進行成分分析，表明白木通是非常有價值的資源，可開發(fā)利用［2］。大量研究［3－5］表明，經(jīng)Alcalase酶修飾處理過的蛋白擁有比原蛋白更優(yōu)的營養(yǎng)或功能性質(zhì)，所以Alcalase酶已被廣泛應(yīng)用制備蛋白酶解物。由于白木通籽分離蛋白的溶解性等性質(zhì)在中性環(huán)境中較差，本試驗擬采用Alcalase酶對其進行改性，并考察水解度對其功能性質(zhì)的影響，旨為其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白木通籽分離蛋白：蛋白純度86.63%，實驗室自制；

Alcalase酶：丹麥諾維信公司；

疊氮鈉、十二烷基硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等：均為分析純，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

高速勻漿機：FSH－II，江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠；

氨基酸自動分析儀：L8800，日本日立公司；

差示掃描量熱儀：PYRIS DIAMOND，美國PE公司；

紫外分光光度計：新世紀T6，北京普析通用儀器有限公司；

冷凍干燥機：FD－1，北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解物的制備 參照文獻［6］，略作修改。將10g白木通籽分離蛋白粉末分散在200mL 蒸餾水中，水浴升溫至55 ℃，并用0.5mol／L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至8.0。按照酶／蛋白底物4∶100的比例加入Alcalase酶開始水解，反應(yīng)過程中通過加入0.5mol／L氫氧化鈉維持溶液pH 8.0。反應(yīng)一定時間后，將燒杯置于90 ℃水浴中滅酶10min，離心（5 000×g，20min）取上清液冷凍干燥得到各種水解度的酶解產(chǎn)物。

1.3.2 水解度的測定 采用pH－stat法［7］。

1.3.3 氨基酸組成 稱取白木通分離蛋白及其酶解物各0.25g，將樣品置于水解管中，加入含有10 mmol／L 多酚的6mol／L鹽酸溶液，真空封口。在110 ℃下水解24h，冷卻后定容、過濾并蒸干，采用氨基酸自動分析儀測定蛋白質(zhì)的氨基酸含量。氨基酸含量以g／100g 蛋白表示。

1.3.4 示差掃描量熱測定 采用差示掃描量熱儀在20～200 ℃對樣品進行掃描，測定各酶解物的熱變性溫度。

1.3.5 溶解性 將蛋白樣品溶于蒸餾水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為1%的蛋白溶液，于磁力攪拌器上攪拌30min使其充分分散，再用0.5mol／L鹽酸或0.5mol／L氫氧化鈉將溶液pH分別調(diào)至3.0～9.0，25℃繼續(xù)攪拌溶解30min后5 000×g離心15min。以牛血清蛋白為標準蛋白，用Lowry法［8］測定上清液中蛋白質(zhì)的含量。溶解度按式（1）計算。

式中：

NSI—— 溶解度，%；

m—— 上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；

M—— 樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g。

1.3.6 乳化性與乳化穩(wěn)定性 參照文獻［9］，略作修改。稱取蛋白樣品溶解于蒸餾水中，配成蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.1%的溶液。用0.5mol／L鹽酸或0.5mol／L氫氧化鈉調(diào)pH 值至2.0～9.0。常溫下磁力攪拌30min后，取9mL 不同pH 值條件下蛋白溶液與3 mL 大豆油混合，放入50 mL 離心管中。在高速勻漿機作用下乳化60s（15 000r／min），迅速取50μL的乳化液與5mL，0.1%的SDS混合，在500nm 處測定吸光值，用0.1%的SDS 做空白對照。以乳化活力指數(shù)（emulsification activity index，EAI）表示蛋白乳化活性。乳化活力指數(shù)按式（2）計算。

式中：

EAI—— 乳化活力指數(shù)，m2／g；

A0——0min時取樣測定的吸光值；

D—— 稀釋倍數(shù)；

c—— 乳化液形成前蛋白濃度，g／mL；

φ—— 光學(xué)路程，cm；

θ—— 乳化液中油的體積分數(shù)，L／L；

乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）表示。乳化穩(wěn)定指數(shù)按式（3）計算。

式中：

ESI—— 乳化穩(wěn)定指數(shù)，min；

Δt—— 靜置時間，10min；

A0——0min時取樣測定的吸光值；

A10—— 靜置10min后測定的吸光值。

1.3.7 起泡性與起泡穩(wěn)定性 參照文獻［10］以不同pH 值（3.0，5.0，7.0，9.0）的磷酸緩沖溶液配制20mL 質(zhì)量濃度為1% 的蛋白溶液，用高速分散勻漿機以15 000r／min均質(zhì)1min，迅速記錄泡沫所占的體積；室溫下靜置30min后，再次記錄泡沫的殘余體積，分別按式（4）、（5）計算起泡性和起泡穩(wěn)定性：

式中：

FC—— 起泡性，%；

FS—— 起泡穩(wěn)定性，%；

V1—— 均質(zhì)后記錄的泡沫體積，mL；

V2—— 靜置30min后記錄的泡沫體積，mL；

V0—— 蛋白溶液的體積，即20mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解過程水解度的變化

采用pH－stat法測定水解300min過程中白木通籽分離蛋白水解度變化情況，結(jié)果見圖1。

圖1 酶解過程中分離蛋白水解度隨時間變化情況Figure 1 Degree of hydrolysis of API treated with Alcalase 2.4Las influenced by time

由圖1可知，水解度隨著反應(yīng)時間的增加而增加，說明隨著酶解的進行，多肽片段慢慢被釋放出來。酶解5 min后，水解度達4.48%，反應(yīng)30min后，水解度可達8.9%。在剛開始的40min內(nèi)，水解速率快速上升，而后緩慢釋放出多肽片段。反應(yīng)進行到200 min后，反應(yīng)速度幾乎沒有變化。水解度的這種變化趨勢，與用Alcalase酶處理小麥分離蛋白時水解度的變化趨勢十分相似［11］。本試驗為研究限制性酶解對分離蛋白理化性質(zhì)的影響，選用水解時間為10，30，240min即水解度分別為6.1%，8.9%，12.8%的酶解產(chǎn)物進行分析研究。

2.2 氨基酸組成

表1是分離蛋白和經(jīng)過不同時間酶解后的酶解物的氨基酸組成結(jié)果。經(jīng)限制性酶解后，不同水解度的酶解產(chǎn)物的氨基酸組成差別不大。另一方面，白木通籽分離蛋白在不同時間段生成的酶解物的氨基酸組成模式能夠探討分析它們的抗氧化活性及其相關(guān)機制。表1 顯示，分離蛋白經(jīng)酶解后，疏水性氨基酸總量在不同水解度（6.1%，8.9%，12.8%）中均顯著提高，分別為42.11%，42.03%，41.69%。酶解物中的單個氨基酸可能參與到抗氧化過程中來。據(jù)報道［12］，賴氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、酪氨酸和色氨酸這幾種氨基酸在酶解物中對抗氧化活性有顯著的貢獻作用。而與甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和纈氨酸相比，色氨酸和組氨酸的抗氧化能力更強［13］。組氨酸和含組氨酸的多肽的抗氧化活性歸因于其咪唑環(huán)的螯合和脂質(zhì)自由基猝滅作用，而多肽中的酪氨酸殘基可能會充當氫供體的角色［14，15］。一般而言，因為芳香族氨基酸較易貢獻質(zhì)子給電子缺乏的原子團，所以被認為是有效的自由基清除劑。由結(jié)果可知，賴氨酸、甲硫氨酸、組氨酸和酪氨酸含量經(jīng)酶解后均有所增加，說明白木通籽分離蛋白經(jīng)Alcalase酶解后的抗氧化活性將會增強。

2.3 熱學(xué)性質(zhì)

熱變性溫度（Td）是衡量一種物質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要參數(shù)，較高的熱變性溫度意味著該物質(zhì)擁有較強的熱穩(wěn)定性，在加工過程中能夠耐受較高的溫度［16］。

采用示差掃描量熱測定白木通籽分離蛋白及其酶解物的熱變性溫度，結(jié)果見圖2。分離蛋白和它的酶解物擁有不同的熱轉(zhuǎn)變曲線。分離蛋白呈現(xiàn)一個典型的吸熱峰，變性溫度為91 ℃左右。與分離蛋白相比，在各酶解產(chǎn)物中，可見較高的變性溫度，酶解的大豆蛋白的變性溫度也會出現(xiàn)同樣的變化趨勢。隨著水解度從6.1% 增加到8.9% 或12.8%，主要吸熱峰的變性溫度從92.4 ℃上升到97.6～98.4 ℃。

同時，隨著水解度從0 到12.8%，分離蛋白的熱焓值（△H）顯著降低（P＜0.05）。熱焓值體現(xiàn)了一種蛋白有序結(jié)構(gòu)的程度［17］，因此，隨著酶解的進行，分離蛋白的有序結(jié)構(gòu)程度將會逐漸降低。

2.4 溶解性

分離蛋白及其酶解物在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)的溶解性見圖3。分離蛋白在pH 4.0～6.0時溶解度很低，pH 9.0處呈現(xiàn)較高的溶解性，達80.12%。然而，經(jīng)酶解后，分離蛋白在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)得到顯著提高，并且溶解度隨著水解度的升高而升高。在低水解度（6.1%）時，其溶解度從2.2%～15.2%相應(yīng)增加到30.5%～55.9%。當水解度達12.8%時，在所有測定的pH 值范圍內(nèi)，78%以上的蛋白都是可溶的。在pH 7.0處，水解度為0，6.1%，8.9%，12.8%的蛋白相對應(yīng)的溶解度分別為35.8%，75.1%，82.1%，90.7%。溶解度提高的原因在于蛋白質(zhì)或多肽等酶解后，產(chǎn)生的寡肽擁有更強的極性，能夠形成強親水鍵與水相互作用而呈現(xiàn)較高的溶解性［18］。

表1 分離蛋白及其酶解物的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of API and its hydrolysates（n＝3）

圖2 分離蛋白及其酶解物的DSC圖譜Figure 2 Differential scanning calorimetry（DSC）of API and its hydrolysates

圖3 分離蛋白及其酶解物溶解性隨pH 變化情況Figure 3 Solubility of API and its hydrolysates as influenced by pH

2.5 乳化性與乳化穩(wěn)定性

由圖4和5可知，分離蛋白經(jīng)不同程度的水解后，各酶解物乳化活性和乳化穩(wěn)定性在所有pH 范圍內(nèi)均得到顯著提高，并且各水解度酶解物乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨pH 值變化趨勢一致。然而，過度酶解（大于10min）后，酶解物乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著水解度的增加反而逐漸降低（P＜0.05）。此結(jié)果表明，過度的水解對于蛋白乳化性能的改善是不利的。乳化性能的高低取決于蛋白質(zhì)兩親性能的強弱，以上現(xiàn)象可能是酶解產(chǎn)生的低分子量肽的兩親性降低導(dǎo)致的結(jié)果。李玉珍等［19］同樣也發(fā)現(xiàn)過度酶解能夠?qū)е碌鞍椎娜榛钚源蟠蟮亟档?。雖然小肽能夠迅速地擴散到油水界面，但是電荷排斥導(dǎo)致小肽很難凝聚形成厚的球狀薄膜，從而導(dǎo)致它們穩(wěn)定乳液的效率低下［20］。從已有文獻［21，22］來看，有大量過度酶解導(dǎo)致蛋白乳化性能降低的報道。

圖4 分離蛋白及其酶解物的乳化活性指數(shù)隨pH 變化的情況Figure 4 Emulsifying activity index（EAI）of API and its hydrolysates as influenced by pH

圖5 分離蛋白及其酶解物的乳化穩(wěn)定性指數(shù)隨pH 變化的情況Figure 5 Emulsification stability index（ESI）of API and its hydrolysates as influenced by pH

2.6 起泡性與起泡穩(wěn)定性

分散到溶液中的蛋白質(zhì)能夠降低水與空氣界面的表面張力，從而產(chǎn)生泡沫［23］。分離蛋白及其酶解物在不同pH 值（3.0，5.0，7.0，9.0）條件下的起泡性質(zhì)結(jié)果見圖6。在試驗pH 值范圍內(nèi)，各酶解物的起泡性能比之分離蛋白相對提高，但隨著水解度的增加，起泡性和起泡穩(wěn)定性略有降低。一般而言，分子量越大，蛋白或多肽起泡穩(wěn)定性能越好，結(jié)果表明高分子量多肽或部分水解的蛋白在空氣與水界面能夠保持優(yōu)良的薄膜內(nèi)聚性，與之前Kong等［24］報道的結(jié)果一致。另外，從結(jié)果來看，分散介質(zhì)的pH 值能夠極大地影響酶解物的起泡性能，特別是起泡穩(wěn)定性（圖7）。在pH 5.0處，由于接近它們的等電點，溶解性低，故起泡與起泡穩(wěn)定性最差。

圖6 分離蛋白及其酶解物起泡性能隨pH 變化的情況Figure 6 Foaming capacity of API and its hydrolysates as influenced by pH

圖7 分離蛋白及其酶解物起泡穩(wěn)定性能隨pH 變化的情況Figure 7 Foaming stability of API and its hydrolysates as influenced by pH

3 結(jié)論

本試驗以白木通籽分離蛋白為原料，利用堿性蛋白酶，在溫度55 ℃、底物濃度2%和pH 8.0條件下對白木通籽分離蛋白進行限制性酶解，探討不同水解度對酶解產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響。氨基酸分析表明，分離蛋白經(jīng)酶解后，疏水性氨基酸總量增加。具抗氧化活性的氨基酸殘基相對含量均得到不同程度地提高，但是，不同水解度的酶解物的氨基酸組成模式比較接近。分離蛋白隨酶解時間的增加，主要吸熱峰的變性溫度從92.4 ℃上升到97.6～98.4 ℃，而其熱焓值反而顯著降低，使得分離蛋白的有序結(jié)構(gòu)分散開來。不同酶解物在所測pH 值范圍內(nèi)的溶解度均相應(yīng)增加，并且溶解度隨著水解度的升高而升高。說明分離蛋白經(jīng)酶解后，產(chǎn)生的寡肽擁有更強的極性，能夠形成強親水鍵與水相互作用而呈現(xiàn)較高的溶解性。各水解度酶解物乳化和起泡性與pH 值變化趨勢一致，同時，其乳化性能和起泡性能隨著酶解的進行，均出現(xiàn)先增加后減少的趨勢，但總體還是高于分離蛋白相對應(yīng)值。說明過度的水解不利于白木通籽分離蛋白的乳化和起泡性能。

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