原發(fā)性肝癌早期診斷特異分子標(biāo)志物的研究進(jìn)展

姚登福，姚 敏，蔚丹丹，嚴(yán)曉娣，陳 潔

南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南通 226001

原發(fā)性肝癌(primary hepatocarcinoma，PHC)的防治是全世界的醫(yī)學(xué)難題，近半數(shù)的肝癌病例在我國(guó)，已是僅次于肺癌的常見(jiàn)惡性腫瘤。肝癌形成是多基因異常、多階段發(fā)展的復(fù)雜過(guò)程。已報(bào)道的與PHC診斷相關(guān)的標(biāo)志物眾多，其中血AFP為應(yīng)用最廣泛的診斷標(biāo)記物，但單純以AFP診斷PHC已難以滿足臨床需要，且敏感性和特異性均難令人滿意［1-2］。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多種“組學(xué)”技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)分子如肝癌特異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，可明顯改進(jìn)PHC診斷特異性;發(fā)現(xiàn)肝癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄異常，可監(jiān)測(cè)PHC微小轉(zhuǎn)移［3-4］。本文就PHC早期診斷特異標(biāo)志的研究進(jìn)展作一述評(píng)。

1 分子診斷基礎(chǔ)

PHC是由病毒、化學(xué)致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相關(guān)基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些癌基因重新復(fù)活等諸多因素引起肝細(xì)胞生長(zhǎng)失控而致癌變，其中數(shù)百種基因調(diào)控和表達(dá)與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［5-6］。從PHC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中基因表達(dá)譜分析，為探討肝癌多基因參與的復(fù)雜過(guò)程提供了新的途徑，以揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制，或作為早期診斷、分子分型、療效和預(yù)后判斷的依據(jù)。肝癌模型證實(shí)，鼠肝28000個(gè)基因表達(dá)譜在肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化早期，約有3000個(gè)基因上調(diào)，近300個(gè)基因上調(diào)幅度大于8倍;主要涉及細(xì)胞周期、炎癥相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤轉(zhuǎn)移、凋亡抑制和抑癌基因等［7］。

伴隨肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，蛋白表達(dá)譜發(fā)生異常改變。蛋白質(zhì)組學(xué)在研究肝癌發(fā)生機(jī)制、尋找肝癌診斷的特異性標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)等方面已進(jìn)行了一些有意義的探索。隨著該項(xiàng)技術(shù)改進(jìn)，相信會(huì)有靈敏、經(jīng)濟(jì)、快捷方法用于臨床，以提高肝癌早期診斷的陽(yáng)性率。以表面增強(qiáng)的激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDITOFMS)分析良、惡肝病患者血清蛋白譜型，對(duì)PHC診斷特異性蛋白篩選有一定價(jià)值，蛋白標(biāo)志的靈敏度和特異度較高，操作簡(jiǎn)單，正確率優(yōu)于AFP［8］。

2 肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白

2.1 HS-AFP 以親和層析原理，從總AFP中分離出的HS-AFP(或稱AFP-L3)，占血清總 AFP的10%左右，是PHC患者血中最主要的AFP異質(zhì)體;HS-AFP增加反映HCC的惡性程度，被認(rèn)為是PHC早期特異診斷的潛在分子標(biāo)志;HS-AFP定量的臨床資料顯示，對(duì)肝癌診斷的特異性大于 95%［9-10］;在慢性 HBV/HCV或肝硬化患者，如HS-AFP異常，高度提示該患者可能是PHC高危人群，需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè);HS-AFP比影像學(xué)檢查早9～12個(gè)月檢測(cè)出肝硬化患者中的早期PHC。

2.2 HS-GGT HS-GGT是從總GGT分離出對(duì)肝癌診斷具有特異性的胚胎型部分(Ⅰ’、Ⅱ、Ⅱ’)，對(duì)PHC診斷的敏感性在85%左右，早期診斷價(jià)值不亞于AFP。對(duì)AFP假陰性肝癌(＜50 g/L)和小肝癌的診斷率分別為84.0%、78.6%(AFP僅為50%)。與 AFP濃度或腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)［11］。通過(guò)多項(xiàng)標(biāo)志物的篩選，認(rèn)為HS-GGT可作為AFP以外的最佳肝癌標(biāo)志物。GGT-mRNA可望成為檢測(cè)肝細(xì)胞早期癌變的靈敏方法。肝GGT基因可分為3種亞型:即胎肝(F)、胎盤(P)和肝癌細(xì)胞(H)亞型，其中H亞型陽(yáng)性可能為肝細(xì)胞的癌前期病變。

3 肝細(xì)胞相關(guān)生長(zhǎng)因子

3.1 胰島素樣生長(zhǎng)因子亞組分(IGF-Ⅱ) 肝臟發(fā)育過(guò)程中IGF-Ⅱ基因以啟動(dòng)子、甲基化程度、印跡狀態(tài)等進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。肝臟是合成和分泌IGF-Ⅱ的主要器官，在肝細(xì)胞癌變過(guò)程中胚胎型IGF-Ⅱ基因活化，激活已關(guān)閉的啟動(dòng)子P3而產(chǎn)生胚胎表型逆轉(zhuǎn)，使IGF-Ⅱ過(guò)表達(dá)，經(jīng)IGF-Ⅰ受體上酪氨酸激酶途徑合成與活化。肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，IGF-Ⅱ呈進(jìn)行性增加。肝癌發(fā)生早期IGF-Ⅱ異常并伴有脈管區(qū)卵圓細(xì)胞的出現(xiàn)，免疫組織化學(xué)證實(shí)小肝癌中可見(jiàn)IGF-Ⅱ呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，高達(dá)40～100倍;另外IGF-Ⅱ與PHC分化程度有關(guān)，低分化肝癌中見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。IGF-Ⅱ表達(dá)異常與肝病患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，肝癌和部分癌旁組織中表達(dá)，而遠(yuǎn)癌組織不表達(dá)［12-13］。

3.2 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 亞組分(TGF-β1)TGF-β1 是TGF-β家族的成員，是一種與正常和變異細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)有關(guān)的多功能細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大而可逆的生長(zhǎng)抑制活性以及免疫抑制作用。TGF-β1為一種多功能生長(zhǎng)因子，在胚胎發(fā)生發(fā)展、肝細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程中起重要作用，與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［14］。肝癌模型的動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn)在誘癌過(guò)程中，隨著肝細(xì)胞癌變發(fā)生，肝細(xì)胞總漿蛋白濃度變化不明顯，但TGF-β1表達(dá)進(jìn)行性升高;肝細(xì)胞癌前病變組已明顯高于正常對(duì)照組;肝細(xì)胞癌變組活性達(dá)高峰。小分子TGF-β1極易釋放入血，因此血TGF-β1也顯著增加，且兩者呈明顯的正相關(guān)，提示PHC是TGF-β1高表達(dá)腫瘤，TGF-β1可能參與肝細(xì)胞癌變過(guò)程，濃度的進(jìn)行性升高可反映肝細(xì)胞的早期癌變。

3.3 血管生成素亞組分(Ang-2) 血管生成是PHC生長(zhǎng)、進(jìn)展的關(guān)鍵步驟。PHC為血供豐富的惡性腫瘤，多種細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)。Ang主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞合成，經(jīng)自分泌作用與細(xì)胞膜上酪氨酸激酶受體(Tie)-2特異結(jié)合，但不引起受體磷酸化和隨后的信號(hào)傳遞。Ang主要由 Ang-1和Ang-2組成，是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定及促進(jìn)血管重構(gòu)，促血管新生的血管生成因子，Ang-2與肝癌發(fā)生關(guān)系最為密切［15］。肝細(xì)胞發(fā)生癌變過(guò)程中，肝Ang-2呈進(jìn)行性動(dòng)態(tài)表達(dá)。肝病患者血Ang-2水平，急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化患者較低，肝癌患者較高，隨肝病進(jìn)展呈進(jìn)行性增加，與VEGF呈顯著正相關(guān)(r=0.769);如以血Ang-2＞35 ng/mL為界，肝癌組95%異常，Ang-2過(guò)表達(dá)有助于肝癌的診斷與鑒別。

3.4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 新血管生成是肝癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，是癌細(xì)胞播散的途徑，促進(jìn)血管滲漏。VEGF表達(dá)調(diào)控較為復(fù)雜，突變的ras癌基因可使VEGF表達(dá)增強(qiáng)，而ras表達(dá)抑制物可顯著降低VEGF活性;突變的P53基因可增強(qiáng)蛋白激酶活性，以誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，保持腫瘤無(wú)限制侵襲性生長(zhǎng)，癌組織須依賴持續(xù)廣泛的新生血管形成;VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜兩種酪氨酸激酶受體結(jié)合發(fā)揮作用，具有促進(jìn)不同來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和血管構(gòu)建的作用，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞的遷移。誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶和組織因子，誘導(dǎo)血管形成;同時(shí)并參與促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)傳遞，與炎癥介質(zhì)間具有良好相關(guān)性，以自分泌或旁分泌而相互作用。VEGF能激活癌血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可作為肝癌血管生成的早期標(biāo)志［16］。

4 膜蛋白與肝癌

4.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖亞組分(肝癌特異組分，GPC-3)GPC-3在PHC發(fā)展過(guò)程中過(guò)表達(dá)，位于胞質(zhì)和胞膜，癌旁定位于胞質(zhì)，而遠(yuǎn)癌肝組織未見(jiàn)表達(dá)。且癌GPC-3強(qiáng)度高于癌旁和遠(yuǎn)癌肝組織，與HBV感染相關(guān)，HBsAg陽(yáng)性組高于陰性組，與AFP聯(lián)檢可提高診斷率。GPC-3過(guò)表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、FGF2、FGFR1、FGFR2、硫酸酯酶 1(SULF1)和SULF2顯著相關(guān)，GPC-3是一種分泌型糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白，半數(shù)PHC患者血中可測(cè)到GPC-3，而肝硬化、慢性肝炎和健康人血中未測(cè)出。GPC-3表達(dá)與瘤體大小有關(guān)，肝癌＜3.0 cm組明顯高于≥3.0 cm組，中、低分化癌組織GPC-3陽(yáng)性率明顯高于高分化肝癌，過(guò)表達(dá)肝癌預(yù)后差［17-18］。

4.2 高爾基蛋白亞組分(GP-73)GP-73是存在于細(xì)胞高爾基體的一種跨膜蛋白，是病毒感染的肝細(xì)胞內(nèi)具有正調(diào)節(jié)作用的固有高爾基蛋白。GP-73在健康人群和非肝病患者中GP-73水平低，HBV攜帶者GP-73水平雖高于健康者和非肝病患者，但遠(yuǎn)低于肝癌患者。肝癌患者GP-73水平是HBV攜帶者的20倍。早期PHC診斷，GP-73敏感性明顯高于AFP。GP-73主要由膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，深入研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論何種原因引起的肝病，患者GP-73水平均顯著上調(diào)。非肝病患者和正常人GP-73水平相近;GP-73診斷肝癌的敏感性為76.9%，特異性達(dá)92.8%，與腫瘤大小和分級(jí)未見(jiàn)確切關(guān)系。GP-73具有應(yīng)用前景，尚須更多病例證實(shí)和長(zhǎng)期隨訪，以及了解GP73在其他肝臟占位性病變中的表達(dá)等。肝癌患者血GP-73顯著升高，早期診斷肝癌的診斷優(yōu)于AFP，而GP-73異質(zhì)體的敏感性和特異性則高達(dá)90%、100%，可能是肝癌可靠的診斷標(biāo)志物［19-20］。

4.3 膜聯(lián)蛋白A2(Annexins A2，ANXA2) 膜聯(lián)蛋白是一個(gè)鈣離子依賴的、陰離子的磷脂結(jié)合蛋白家族，故又稱為鈣磷脂結(jié)合蛋白。其家族已報(bào)道至少160種家族成員，且大多數(shù)都有重要的蛋白結(jié)合伴侶，最典型的代表就是ANXA2，其表達(dá)及蛋白翻譯后異常修飾與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。鑒于ANXA2在正常肝組織、PHC癌旁和PHC癌組織表達(dá)差異顯著，可將ANXA2作為肝細(xì)胞癌標(biāo)志物。免疫組化分析ANXA2表達(dá)，并結(jié)合其他肝癌標(biāo)志物(GPC-3和Hsp70)，可增加PHC診斷準(zhǔn)確性，靈敏度74%，特異性100%;ANXA2作為新生血管敏感而特異性標(biāo)志，加入已經(jīng)建立的診斷標(biāo)準(zhǔn)，使肝活檢診斷 PHC更可靠。血ANXA2濃度與光密度在0～10 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，最低檢出敏感性是0.02 μg/mL。用于臨床顯示PHC病人血ANXA2濃度明顯高于正常對(duì)照，可為PHC 診斷靈敏標(biāo)志［21］。

5 外周血相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄異常

5.1 微RNA(miRNA)表達(dá)譜改變 miRNA是由21～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，通過(guò)翻譯抑制或降解靶mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、病毒感染以及癌變等多種病理生理過(guò)程中起著重要的作用。肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)惡性腫瘤，最新的研究表明miRNA直接參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，且與肝細(xì)胞癌的診斷、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等相關(guān)。Ura等以RT-PCR擴(kuò)增分析了HBV和HCV相關(guān)PHC組織的188個(gè)miRNAs，發(fā)現(xiàn) has-miR-122a、-199和-223等17種低表達(dá)，與上調(diào)腫瘤相關(guān)途徑如細(xì)胞周期、黏附、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān);6種中高表達(dá)如 has-miR-21、98、221、222等，與下調(diào)抗腫瘤免疫等有關(guān)，miRNAs表達(dá)譜在肝癌早期診斷具有應(yīng)用前景［22-23］。

5.2 IGF-Ⅱ mRNA 在肝癌發(fā)生過(guò)程中，胚胎型IGF-Ⅱ mRNA重新表達(dá)，IGF-Ⅱ表達(dá)上調(diào)。肝組織IGF-Ⅱ表達(dá)，受4個(gè)啟動(dòng)子(P1～4)調(diào)控，其中胚胎型P3啟動(dòng)子活化是導(dǎo)致IGF-Ⅱ持續(xù)表達(dá)，細(xì)胞增殖以致形成肝細(xì)胞癌的重要驅(qū)動(dòng)因素，且其過(guò)高表達(dá)與P3和P4啟動(dòng)子的再激活及P1啟動(dòng)子失活高度相關(guān)。肝癌患者外周血 IGF-Ⅱ mRNA陽(yáng)性率為34.2%，當(dāng)將IGF-Ⅱ的臨界值定為4.1 mg/mL時(shí)，診斷小肝癌的敏感性為63%，特異性為90%，提示IGF-Ⅱ是小肝癌和PHC早期診斷的敏感血清標(biāo)記物［13］。

5.3 TGF-β1 mRNA TGF-β1 mRNA 在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時(shí)進(jìn)行性增高，肝癌形成時(shí)達(dá)高峰，是PHC發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)記。肝癌組織、癌旁組織和外周血中TGF-β1 mRNA 陽(yáng) 性 率 分 別 為 100%、46.2% 和53.3%;Ⅲ期肝癌為83.3%，高于Ⅰ期和Ⅱ期肝癌，TGF-β1和TGF-β1 mRNA可成為PHC早期檢測(cè)的敏感標(biāo)記物。血TGF-β1診斷PHC的敏感性為74.4%，特異性為77.9%，與 AFP聯(lián)檢陽(yáng)性率達(dá)95.5%;對(duì)AFP陰性PHC及小肝癌的診斷陽(yáng)性率也可達(dá)85.7%［14］。尿中 TGF-β1 水平與 PHC 顯著相關(guān)，對(duì)AFP陰性或低濃度PHC的診斷有較高價(jià)值。

5.4 GPC-3 mRNA GPC-3 mRNA在非肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)均不表達(dá)，故認(rèn)為GPC-3 mRNA在AFP陰性肝癌中特異性表達(dá)，可作為PHC的新基因標(biāo)志。免疫組化顯示PHC中陽(yáng)性率為72%，正常肝和良性肝病未檢測(cè)到。另HCC患者血中可檢到GPC-3可溶性NH2-末端片段(sGPC-3)，將sGPC-3作為早期PHC的血清學(xué)標(biāo)記物。GPC-3過(guò)表達(dá)與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，肝癌模型顯示從肝細(xì)胞顆粒樣變性、不典型增生(癌前期)及癌形成時(shí)，肝GPC-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及GPC-3梯度表達(dá)呈正相關(guān)，與組織學(xué)一致，過(guò)表達(dá)是肝細(xì)胞惡性改變的早期事件［18］。

6 展望

肝癌的手術(shù)切除仍是治療的首選方法。肝癌的惡性程度極高，早診早治和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)是提高患者存活率的唯一途徑。肝癌形成是多基因異常、多階段發(fā)展的復(fù)雜過(guò)程，已報(bào)道的與肝癌診斷相關(guān)的標(biāo)志物眾多，單純以AFP診斷肝癌，其敏感性和特異性均難令人滿意［24-25］。近來(lái)質(zhì)譜、基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤免疫等相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用，已篩選出一些潛在的具有診斷特異性的標(biāo)志物，如HS-GGT、HS-AFP和GPC-3等。肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生、發(fā)展關(guān)鍵信號(hào)通路的闡明將為肝癌的診斷帶來(lái)新的契機(jī)。多種具有診斷特異性標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用，可有效提高肝癌診斷的敏感性及特異性，也利于AFP陰性或低濃度肝癌的早期發(fā)現(xiàn)。

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