甘草酸銨通過抑制HMGB1的表達減輕ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷

黃繼英，韓 冰，張順財，涂傳濤

1．復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院消化科，上海201700;2．復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科

刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)的T細胞介導(dǎo)的免疫性肝炎模型類似人類自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)［1］，利用該模型有助于進一步認識AIH發(fā)生的分子機制與探索有效防治藥物。甘草酸類藥物因具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)雙重作用［2-4］，在動物實驗和臨床實踐中均證實具有防治肝損傷的作用［2-4］。然而，甘草酸類制劑作用的分子機制還有待進一步闡明。

近年來，發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白-1(high-mobility group box 1，HMGB1)能促進細胞因子釋放，是一種具有炎癥因子活性的核蛋白［5-6］。大量研究證實HMGB1是參與炎癥形成與進展的必須介質(zhì)，即便是在無感染的情況下也是如此，如實驗性免疫性關(guān)節(jié)炎、腦缺血、失血性休克、胰腺炎、無菌性肝壞死等所致的炎癥與組織損傷［5-7］。因此，HMGB1可作為分子治療的潛在靶點［5-6］。為此，本研究應(yīng)用ConA誘導(dǎo)免疫性肝炎小鼠模型，探討甘草酸銨對ConA誘導(dǎo)免疫肝炎的防治作用是否與抑制肝組織HMGB1表達有關(guān)。

1 材料與方法

1．1 試劑 刀豆蛋白A和甘草酸銨(Glycyrrhizic acid ammonium salt)購于Sigma-Aldrich公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海西唐生物公司，TNF-α、IFN-γ和IL-10酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒為R＆D Systems公司產(chǎn)品，兔抗HMGB1單克隆抗體為Epitomics公司產(chǎn)品，過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG購于杭州宜康生物技術(shù)有限公司;總RNA提取試劑盒、RNA酶抑制劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1．2 實驗動物分組與處理 清潔級雄性BALB/c小鼠40只(體質(zhì)量20～25 g)，購于復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心。實驗前預(yù)飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境和條件遵循實驗室動物飼養(yǎng)條例。將小鼠隨機分為3組，用ConA(20 mg/kg)尾靜脈注射誘導(dǎo)免疫性肝炎，ConA溶入PBS中。預(yù)防組(n=15)和模型組(n=15)在ConA注射前30 min分別給予甘草酸銨(100 mg/kg，溶入生理鹽水)和等體積生理鹽水腹腔注射;正常對照組(n=10)則以相應(yīng)等體積的PBS尾靜脈注射和生理鹽水腹腔注射。在ConA給藥后第8 h對實驗小鼠采血并處死后留取肝組織。

1．3 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)水平檢測 采用全自動生化分析儀(Hitachi Auto Analyzer 7170，日本)。

1．4 肝組織學(xué)檢測 肝組織于4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、脫水，切片厚4～5 μm，常規(guī)H＆E染色后顯微鏡下觀察肝組織炎癥壞死情況。

1．5 免疫組織化學(xué) 采用石蠟切片VECTASTAIN ABC法(上海普飛生物公司)，按試劑盒說明操作。微波修復(fù)抗原;封閉內(nèi)源性生物素;兔抗HMGB1單克隆HMBG1抗體的工作濃度分別為1∶100，孵育30 min;隨后加入二抗，工作濃度均為1∶100;最后經(jīng)DAB顯色，顯微鏡觀察結(jié)果。免疫組化半定量分析:參照文獻稍有改動［7-8］，即:每組隨機選5張切片(要求分別來自不同的小鼠)，在高倍顯微鏡下(400×)隨機選擇5個視野，記錄每個視野內(nèi)所有的陽性表達的細胞數(shù)，陽性細胞界定為肝竇內(nèi)的陽性細胞及僅在胞漿中表達的肝細胞。

1．6 肝組織ELISA檢測 將－70℃保存的肝組織100 mg置入含蛋白酶抑制劑的勻漿劑中，4℃下震蕩2 h后，將肝組織勻漿4℃12 500×g離心10 min后去渣，將上清液再離心直至清澈后備用。用BCA法測定上清液蛋白濃度，同酶聯(lián)免疫(ELISA)法測量TNF-α、IFN-γ和IL-10含量，按照試劑盒說明進行操作，結(jié)果以pg/μg肝組織蛋白表示。

1．7 實時熒光定量PCR檢測 Trizol試劑一步法提取肝組織中總的RNA，用微量分光光度計檢測RNA樣本純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑合操作擴增cDNA第一鏈，以此為模板進行實時熒光定量PCR擴增，得出各樣本的初始拷貝數(shù)。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照基因。每組樣本一式2份，在指數(shù)期內(nèi)，設(shè)定參數(shù)值，得到每個PCR反應(yīng)的循環(huán)閾(Ct)值，用2－ΔCt值表示mRNA的相對表達量。PCR引物由大連寶生物公司(日本TaKaRa)設(shè)計并合成如下，HMGB1:正義 5'-TGGGCGACTCTGTGCCTC-3'，反義5'-GCCTCTCGGCTTTTTAGGATC-3';GAPDH:正義5'-GCCTTCCGTGTTCCTACC-3'，反義5'-AGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'。

1．8 統(tǒng)計學(xué)分析 所有計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x－±s)表示。SSPS 15．0分析軟件分析各組均數(shù)間的差異，各組數(shù)據(jù)先行方差齊性檢驗后用單因素分析(One way ANOV)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0．01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 甘草酸銨對ConA誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷的影響 ConA誘導(dǎo)的兩組血清ALT和AST水平均顯著高于正常對照組，與模型對照組相比，甘草酸銨預(yù)防組能顯著降低ALT與AST水平(P均＜0．01，見圖1A)。

正常組小鼠光鏡下觀察肝細胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)正常;ConA誘導(dǎo)免疫性肝炎模型組小鼠，光鏡下肝細胞水腫、充血大面積壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見散在橋接樣及小灶樣壞死及炎癥細胞浸潤，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤;甘草酸銨預(yù)防組小鼠，可見肝細胞略有水腫，小灶性壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)可見，少數(shù)不完整，匯管區(qū)可見炎癥細胞浸潤，較對照組明顯減輕。肝組織學(xué)改變與轉(zhuǎn)氨酶水平相一致(見圖1B)。

2．2 甘草酸銨對肝組織炎癥因子水平的影響 ConA

誘導(dǎo)的小鼠組肝內(nèi)TNF-α和INF-γ水平均明顯高于正常對照組(兩者均為P＜0．01)，但與模型組相比，甘草酸銨預(yù)防組并不能顯著降低肝臟TNF-α和INF-γ的水平;具有抗炎作用的IL-10在ConA誘導(dǎo)的各組顯著高于正常對照組，但與模型組相比，甘草酸銨預(yù)防組升高更明顯(P＜0．01，見表1)。

表1 實驗組及對照組肝內(nèi)細胞因子的水平(x－±s，pg/μg)Tab 1 Levels of intrahepatic cytokines in the study and control groups(x－±s，pg/μg)

圖1 甘草酸銨對ConA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響 A:血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST的水平(與正常對照組相比，#P＜0．01;與預(yù)防組相比，*P＜0．01);B:肝組織H＆E染色(100×)Fig1 Effect of glycyrrhizin on ConA-induced liver injury A:Plasma alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase (AST)levels(Compared with PBS control group，#P＜0．01;Compared with protective group，*P＜0．01);B:H＆E staining of liver sections(original magnification 100×)

2．3 甘草酸銨抑制肝臟HMGB1的表達 HMGB1在正常小鼠肝臟中絕大多數(shù)表達在肝細胞核，僅少數(shù)表達在胞漿，呈微弱至中等強調(diào)信號;在ConA誘導(dǎo)的各組中，HMGB1表達信號明顯增強，主要定位在壞死區(qū)域的肝細胞胞漿中，在肝竇內(nèi)也可見散在的陽性細胞，甘草酸銨預(yù)防組表達信號弱于模型組。半定量分析表明，甘草酸銨預(yù)防組陽性細胞數(shù)明顯低于模型組。檢測HMGB1基因同樣證實，甘草酸胺預(yù)防組的表達低于模型組(見圖2)。

3 討論

ConA誘導(dǎo)T-細胞介導(dǎo)的免疫性肝炎模型有助于AIH這類疾病的認識與防治策略的探索。本研究利用該模型，結(jié)果提示甘草酸銨有效防治小鼠免疫性肝損傷，其發(fā)揮作用的分子機制可能與抑制肝組織HMGB1的表達有關(guān)。

甘草酸是甘草中最重要的有效成分之一，甘草酸及其鹽類(即甘草甜素)具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用［2-4］。目前已在多種動物模型中證實甘草酸類制劑的肝臟保護作用［2-3，8-9］。本研究也證實甘草酸銨明顯改善 ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷，與 Tsuruoka等［3］報道一致。同時，我們對肝組織炎癥介質(zhì)(TNF-α、IFN-γ及IL-10)進行檢測，結(jié)果提示甘草酸銨不能抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)TNF-α和IFN-γ升高，肝內(nèi)的結(jié)果與血清學(xué)變化具有一致性［3］，但與生理鹽水預(yù)處理相比，甘草酸銨預(yù)處理能顯著增加肝組織IL-10產(chǎn)生，IL-10具有抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)作用。Tsuruoka等［3］研究顯示，甘草甜素發(fā)揮肝臟保護作用與其抑制肝臟可誘導(dǎo)的一氧化氮酶有關(guān)。此外，甘草酸類制劑還具有抗肝細胞凋亡、抗氧化、抑制促炎因子IL-18釋放等作用。然而，甘草酸作用的分子機制尚未完全闡明。

最近研究表明，HMGB1是重要的細胞外炎癥介質(zhì)，參與多種細胞、組織的炎癥和壞死過程，主要由壞死的細胞被動分泌和免疫細胞主動分泌［5-8］。HMGB1可通過多種受體信號發(fā)揮作用，如Toll樣受體(tolllike receptor，TLR)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，RAGE)、Mac-1和CD24等［4，7］。HMGB1也是參與肝臟損傷與炎癥反應(yīng)關(guān)鍵分子之一［7-9］。本研究表明，甘草酸銨能抑制ConA誘導(dǎo)小鼠肝組織HMGB1的表達，可能是甘草酸類制劑發(fā)揮肝臟保護作用的重要機制之一。最近，Ogiku等［8］研究提示HMGB1參與大鼠肝臟缺血再灌注損傷，也證實甘草甜素具有抑制HMGB1表達的作用，且認為肝臟Kupffer細胞是HMGB1的重要來源?？傊覀冊贑onA誘導(dǎo)的免疫性肝炎模型中也證實了甘草酸銨能抑制HMGB1的表達，說明甘草酸類制劑為作用的靶點是多方面，本研究為甘草酸類制劑為進一步臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

圖2甘草酸銨對ConA誘導(dǎo)肝臟HMGB1 m RNA與蛋白表達的影響 A:免疫組化分析(400×);B:HMGB1陽性細胞數(shù)的評估; C:實時熒光定量PCR測定HMGB1 mRNA(與預(yù)防組相比，*P＜0．01;與正常對照組相比，#P＜0．01)Fig 2 Effect of glycyrrhizin on ConA-induced liver HMGB1 mRNA and protein expression A:Immunohistochemical analysis of HMGB1 in liver(Original magnification 400×);B:The number of HMGB1-positive cells in the hepatic tissue was evaluated;C:The level of HMGB1 mRNA was determinedby quantitative real time PCR(Compared with protective group，*P＜0．01;Compared with PBS control group，#P＜0．01)

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