PTEN下調(diào) paxillin的表達抑制胃癌轉(zhuǎn)移

鄒 榮，于紅剛，周 巍

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其浸潤和轉(zhuǎn)移是影響患者療效及預(yù)后并導(dǎo)致死亡的重要因素，因此，探討胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是目前研究工作的一個重要方面。與張力蛋白同源的第10號染色體丟失的磷酸酶基因PTEN是一種具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因的突變、缺失、失活在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中發(fā)生率較高，失活是因為啟動子甲基化沉默導(dǎo)致的［1］。Paxillin是一種黏著斑信號蛋白，作為一種接頭蛋白在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，主要參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2-3］。目前國內(nèi)外將PTEN與paxillin聯(lián)合起來研究的文章并不多，且采用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)探討PTEN與paxillin的關(guān)系更是少見，本文通過此兩種研究方法探討PTEN與paxillin在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為尋求新的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料及試劑 人胃癌細胞株BGC823(購于上海中科院)，胎牛血清(GIBCO公司)，1640(GIBCO公司)，RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)，小鼠抗人paxillin單克隆抗體(購于ABcom公司)，小鼠抗人PTEN單克隆抗體(購于美國Santa Cruz公司)，兔抗人β-actin單克隆抗體(購于美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(購于美國Santa Cruz公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒(OMEGA公司)，碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)。質(zhì)粒pEAK8和pEAK8-PTEN由李宏宇教授(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科)惠贈。

1．2 方法

1．2．1 瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEAK8及pEAK8-PTEN:以大腸桿菌E．coli為載體擴增質(zhì)粒，按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，于紫外分光光度計下測定質(zhì)粒濃度，細胞饑餓12 h后，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將質(zhì)粒和脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000，購于invitrogen公司)按說明書操作加入到培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)48 h后提蛋白。

1．2．2 Western blot檢測PTEN、paxillin及actin(內(nèi)參)蛋白水平的表達:BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮沸蛋白使蛋白變性;10 μg體積的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上;10%脫脂牛奶封閉;一抗(小鼠抗人PTEN單克隆抗體1∶750稀釋、小鼠抗人paxillin單克隆抗體1∶1 000稀釋、兔抗人β-actin單克隆抗體1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜;TBST洗5 min，3次;二抗(HRP-偶聯(lián)的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG)孵育1 h(1∶1 500稀釋);TBST洗3次，每次10 min;化學(xué)發(fā)光法定影顯影后用數(shù)碼成像系統(tǒng)對膠片進行掃描，利用Quanity One軟件對條帶的灰度值進行分析。

1．2．3 免疫熒光檢測paxillin在細胞內(nèi)的定位:將瞬轉(zhuǎn)pEAK8和pEAK8-PTEN質(zhì)粒的BGC細胞以3×105種入置有蓋玻片的六孔板內(nèi)培養(yǎng)至細胞融合達60%～70%，4%多聚甲醛固定30 min后去固定液，PBS洗滌3次;加入0．2%Triton 100(透膜)靜置10 min，PBS洗滌3次;5%BSA封閉30 min;一抗(小鼠抗人paxillin單克隆抗體1∶100稀釋)4℃孵育過夜;PBS洗3次;二抗(TexRed熒光標(biāo)記，購自Santa Cruz公司)孵育1 h;PBS洗5 min，3次;DAPI(Santa Cruz公司)染色2 min;PBS洗5 min，3次。熒光顯微鏡下觀察。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，不同組間灰度值差異可用單因素方差分析檢驗，PTEN與paxillin的相關(guān)關(guān)系用Spearman秩相關(guān)進行分析，檢驗水準(zhǔn)α=0．05，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 W estern blot檢測 如圖1所示，胃癌細胞中實驗組［pEAK8-PTEN-BGC823(pE-P-B)］與對照組［空白對照BGC823(BGC823)、陰性對照pEAK8-BGC823 (pE-B)］相比，PTEN蛋白水平的表達明顯升高，而paxillin蛋白的表達明顯受到抑制。表1中各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，實驗組與對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，空白對照與陰性對照組中PTEN與 paxillin的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。PTEN與paxillin兩者呈負相關(guān)(r=－0．12，P＜0．05)。actin用于顯示上樣量一致。

圖1 W estern blot檢測PTEN、paxillin、actin蛋白的表達Fig 1 The protein expression of PTEN，paxillin and actin detected by W estern blot

表1 PTEN和paxillin蛋白的表達(±s)Tab 1 The protein expression of PTEN and paxillin(±s)

表1 PTEN和paxillin蛋白的表達(±s)Tab 1 The protein expression of PTEN and paxillin(±s)

分組PTEN Paxillin BGC 0．506±0．015 2．663±0．096 pE-B 0．513±0．006 2．747±0．047 pE-P-B 1．013±0．074 0．883±0．032

2．2 免疫熒光 如圖2所示:胃癌細胞核呈藍色，paxillin位于細胞膜上呈紅色(箭頭所示)，在細胞伸出偽足處聚集。

3 討論

PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因是1997年發(fā)現(xiàn)并命名的一個抑癌基因，定位于染色體10q23，具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。其主要功能是通過脂質(zhì)磷酸酶活性調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/AKT，PI3K/AKT)通路活性，而PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路的激活被認為是腫瘤細胞抗凋亡的主要機制之一。其蛋白磷酸酶活性可使粘著斑激酶(focal adhesional kinase，F(xiàn)AK)蛋白去磷酸化繼而抑制細胞的運動和侵襲能力［2，4］。PTEN蛋白可通過多種信號途徑調(diào)控細胞的增殖、凋亡、運動、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為［5-7］。PTEN基因在多種惡性腫瘤中可發(fā)生突變和缺失，導(dǎo)致腫瘤細胞運動、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強［8-10］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等都有檢測到PTEN基因的突變和缺失。本研究結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP的BGC細胞與空白對照BGC細胞相比，PTEN與paxillin蛋白水平的表達無明顯差異，說明GFP質(zhì)粒對胃癌細胞中的蛋白的生成未產(chǎn)生明顯影響，只是使細胞能發(fā)出綠色熒光;共轉(zhuǎn)質(zhì)粒GFP與PTEN的BGC細胞PTEN的表達明顯高于陰性對照組GFP-BGC細胞和空白對照組BGC細胞，而paxillin的表達明顯低于后兩者，表明PTEN可下調(diào)胃癌細胞中paxillin的表達，與楊麗敏等［11］研究發(fā)現(xiàn)PTEN與paxillin的表達呈負相關(guān)結(jié)論相同。

圖2 免疫熒光檢測paxillin在細胞內(nèi)的定位(400×)a、c、e:pEAK8-BGC823;:b、d、f:pEAK8-PTEN-BGC823Fig 2 The location of paxillin inside cell detected by immunofluorescence(400×)

paxillin是一個分子量為68 KD的黏著斑信號蛋白，是一種重要的細胞黏附分子，主要定位于黏著斑。paxillin分子中含有多種結(jié)構(gòu)域，包括氨基端起蛋白識別作用的5個LD結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的SH3結(jié)構(gòu)域;羧基端介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用的4個串聯(lián)的LIM結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)使paxillin能夠和一系列的信號蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，成為介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要位點。作為一種接頭蛋白，paxillin能將信號從細胞外經(jīng)整合素途徑向細胞內(nèi)傳遞，是細胞骨架與胞外基質(zhì)連接不可缺少的聯(lián)系紐帶。paxillin可通過重排肌動蛋白的細胞骨架，以及與整合素相互作用來調(diào)節(jié)細胞的黏附和運動［12］。細胞的運動是細胞因子或趨化因子引導(dǎo)、肌動蛋白的聚合、新的黏著斑不斷形成和尾端黏著斑協(xié)調(diào)性解聚的多步驟的動態(tài)過程［13-14］，多項研究表明paxillin可動態(tài)調(diào)節(jié)黏著斑、調(diào)節(jié)細胞的運動、播散和轉(zhuǎn)移［15-17］，從而提高腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。本研究中，免疫熒光結(jié)果顯示 paxillin在GFP-BGC細胞伸出偽足處聚集，而在GFP-PTEN-BGC中未見明顯表達。偽足能誘導(dǎo)肌動蛋白重組，形成細胞突起，起到黏附和運動作用［18］。paxillin在偽足聚集，更能促進有偽足形成的癌細胞運動。而此結(jié)果也說明PTEN可抑制paxillin的表達，進一步抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。

正如本研究發(fā)現(xiàn)PTEN可以調(diào)節(jié)paxillin的表達一樣，Herlevsen等［19］也提到PTEN與paxillin有一定的作用關(guān)系，但具體通過何種途徑作用目前仍不是很清楚。也有研究發(fā)現(xiàn)在PTEN的共沉淀物中能檢測到paxillin的沉著［20］。PTEN可通過蛋白磷酸酶活性調(diào)節(jié)FAK的去磷酸化，而paxillin可以作為FAK/Src信號通路的下游信號被磷酸化激活［21］，因此PTEN通過FAK而間接調(diào)節(jié)paxillin的表達也是有可能的。研究表明PPARγ激動劑能上調(diào)PTEN的磷酸化，進而可能導(dǎo)致 FAK和 paxillin的磷酸化［22］。目前將 PTEN、FAK、paxillin三者一起研究的國內(nèi)外文獻甚少，而PTEN調(diào)節(jié)作為信號傳導(dǎo)重要位點的paxillin的表達可能還存在其他的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但其調(diào)節(jié)機制仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究采用了免疫印跡及免疫熒光的方法將PTEN及paxillin聯(lián)合起來研究，證實了PTEN和paxillin都參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，同時過表達PTEN和低表達paxillin影響著胃癌細胞的運動和轉(zhuǎn)移，然而有關(guān)PTEN對paxillin蛋白表達的調(diào)節(jié)機制尚不清楚，具體機制有待下一步的繼續(xù)研究。

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