縫隙連接蛋白Cx43在SD大鼠電點(diǎn)燃癲癇模型中的表達(dá)

宋建華,謝錫駒

(1.江蘇省南通市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇南通,226006; 2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科,江蘇南京,210036)

癲癇的發(fā)病可能與興奮性氨基酸增多、神經(jīng)元缺失、膠質(zhì)細(xì)胞增多、基因變異以及遺傳等有密切的關(guān)系[1],而這些病變都是通過異常、過度的同步性放電來導(dǎo)致癲癇發(fā)作的[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3],縫隙連接蛋白表達(dá)異常與癲癇間存在時間同一性。癥狀性癲癇病灶總是存在于具有縫隙連接的大腦灰質(zhì)區(qū);不同年齡段癲癇發(fā)作的形式與縫隙連接及縫隙連接蛋白在不同年齡段的表達(dá)程度相關(guān)[4];外傷性癲癇之所以在外傷后數(shù)月或數(shù)年后發(fā)病,與損傷的腦組織修復(fù)過程中形成了異常的縫隙連接有關(guān)[5]。這些研究均提示,縫隙連接的異常表達(dá)可能是癲癇發(fā)病的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在制模過程中,應(yīng)用特異性縫隙連接蛋白抑制劑苷酸,以及臨床經(jīng)驗(yàn)性使用預(yù)防癲癇的藥物苯妥英鈉進(jìn)行干預(yù),觀察大鼠電點(diǎn)燃癲癇模型成模過程是否受到抑制,同步檢測縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)水平,探討縫隙連接蛋白與癲癇形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動物:健康成年雄性SD大鼠32只,清潔級,體重220～250 g,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。自然晝夜節(jié)律光照,恒溫25℃,在鼠籠內(nèi)可自由獲得物與水,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。主要試劑購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司,北京博奧森生物技術(shù)有限公司。自制雙極漆包鎳鉻電極(直徑0.1 mm)。實(shí)驗(yàn)平臺由南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 癲癇大鼠模型:①電極植入:(前囟后3. 5 mm,旁開2.0 mm,深度2.5 mm)。②測定SD大鼠痙攣閾值。痙攣閾值確定后5 min以上就可以開始點(diǎn)燃實(shí)驗(yàn)。③雄性SD大鼠隨機(jī)分為假模型組、模型組、苷酸組、苯妥英鈉組。④從第4天開始假模型組、模型組予生理鹽水腹腔注射(10 mL/kg),苷酸組予苷酸腹腔注射(20 mg/ kg),苯妥英鈉組予苯妥英鈉灌胃(100 mg/kg),均1次/d。因?yàn)?2只SD大鼠的痙攣閾值范圍為220～240μV。統(tǒng)一選定200μV作為閾值下刺激。從第4天開始,假模型組僅連接多道生理記錄儀,記錄腦電圖,不發(fā)放刺激電流。其余3組均持續(xù)點(diǎn)燃2 d休息2 d,每天上、下午各點(diǎn)燃一次,共3周。3周后停止藥物干預(yù)與電點(diǎn)燃。

1.2.2 癇性發(fā)作的觀察與腦電圖記錄:根據(jù)經(jīng)典的大鼠癲癇發(fā)作Racine分級判斷大鼠是否有癲癇發(fā)作行為。腦電圖記錄:在每次點(diǎn)燃前5 min開始記錄大鼠腦電圖變化,每次記錄30 min。記錄參數(shù)設(shè)置為:采樣率1 000 Hz,掃描速度100 ms/div,靈敏度200μV,時間常數(shù)0.2 s,低通濾波70 Hz。當(dāng)出現(xiàn)尖波、棘波、尖(棘)慢綜合波、多棘慢綜合波時判定為癲癇腦電活動。

1.2.3 免疫蛋白印跡(Western blot):所有SD大鼠均于術(shù)后32 d急性斷頭取腦,提取海馬(電極部位)蛋白,-80℃保存?zhèn)溆?。?biāo)本收集完成后測定Cx43表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠癇性發(fā)作的表現(xiàn)與評分

假模型組大鼠在4周內(nèi)均未出現(xiàn)癇性發(fā)作。模型組大鼠在亞閾值刺激5 d后就出現(xiàn)Ⅰ～Ⅱ級發(fā)作,2周后可見Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作,但是未見癲癇持續(xù)(SE)。干預(yù)組大鼠在10 d后出現(xiàn)Ⅰ～Ⅱ級發(fā)作,3周后可見Ⅲ級發(fā)作,未出現(xiàn)Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作。對每只SD大鼠按癇性發(fā)作的最高級別評分0～5分。每7 d評分一次,見表1。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)發(fā)作Racine評分比較(n=8,±s)

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)發(fā)作Racine評分比較(n=8,±s)

與模型組比較,33P<0.01

組別 7 d 14 d 21 d 28 d假模型組 0 0 0 0模型組 2.00±0.18 3.62±0.18 4.62±0.18 4.50±0.16苷 酸組2.15±0.1233 2.41±0.2233 2.28±0.1833苯妥英鈉組 0 2.07±0.1433 2.59±0.2633 2.33±0.1933 0

2.2 腦電圖變化

2.3 Western blot測定CX43的表達(dá)

4組兩兩相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),苷酸組與苯妥英鈉組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3-4。

3 討 論

在癲癇的發(fā)病機(jī)制中,神經(jīng)元異常同步放電成為大家所公認(rèn)的原因?？p隙連接是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間唯一能夠直接進(jìn)行物質(zhì)信息交換的快通道,它可能是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞υ神經(jīng)元信息交流的部位之一。早期研究已發(fā)現(xiàn),2個相鄰神經(jīng)節(jié)細(xì)胞動作電位傳遞的間隔時間幾乎為零,縫隙連接的這種直接傳遞,被認(rèn)為是促進(jìn)神經(jīng)元活動達(dá)到同步化的重要原因,所以推測癲癇灶內(nèi)縫隙連接在癲癇發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電點(diǎn)燃后SD大鼠海馬中縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)明顯增高,加用苷酸[6]、苯妥英鈉[7]干預(yù)后,其表達(dá)增高程度受到抑制。受到干預(yù)的SD大鼠癇性發(fā)作改善,Racine分級評分降低。同步腦電圖描記到的癇性電流的振幅下降。檢測到的Cx43表達(dá)下降,具有同步性。苷酸是縫隙連接蛋白特異性抑制劑,作用于縫隙連接?？p隙連接蛋白受到苷酸抑制后,SD大鼠的癇性發(fā)作Racine評分降低,腦電圖癇性腦電波振幅受到抑制。說明縫隙連接蛋白是癇性發(fā)作的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 28 d時的腦電圖A.假模型組;B.模型組;C.苷酸組;D.苯妥英鈉組

圖2 腦電波峰峰值比較A.假模型組;B.模型組;C.苷酸組;D.苯妥英鈉組

圖3 Weston blot測定的Cx43表達(dá)

圖4 4組Cx43表達(dá)情況比較

膠質(zhì)細(xì)胞的生理作用是維持神經(jīng)元所在的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,維護(hù)神經(jīng)元的正常電活動。既往的研究發(fā)現(xiàn)[8],膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇的形成于發(fā)作中也扮演了重要角色。在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的Cx有3種[9]:Cx26、Cx30和Cx43。其中Cx43的表達(dá)量占比接近90%,推測Cx43在癲癇中的形成中占主導(dǎo)作用[10]。因此選擇海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Cx43作為檢測指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)選擇的電點(diǎn)燃模型與以往的其他模型比較,最大的特點(diǎn)是不引起神經(jīng)膠質(zhì)增生、壞死,神經(jīng)變性等形態(tài)學(xué)變化[11-15]。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚐D大鼠海馬區(qū)Cx43表達(dá)增加是單個膠質(zhì)細(xì)胞上Cx43增加的結(jié)果。過度表達(dá)的縫隙連接蛋白在膠質(zhì)細(xì)胞上組成縫隙連接。降低了相鄰神經(jīng)元間的電阻,降低了神經(jīng)元同步放電的閾值。Cx43為什么會過度表達(dá)呢?

每一個膠質(zhì)細(xì)胞都是相對獨(dú)立的個體,具有一定的電容,存在一定電阻。當(dāng)電流負(fù)荷超過膠質(zhì)細(xì)胞最大電容時就會發(fā)生細(xì)胞膜擊穿,細(xì)胞膜擊穿后超負(fù)荷電流得到快速釋放。在這個過程中未誘導(dǎo)單個細(xì)胞凋亡,沒有出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生改變。超負(fù)荷電流釋放后,細(xì)胞膜自我修復(fù)。在點(diǎn)燃試驗(yàn)中,超負(fù)荷電流-細(xì)胞膜擊穿-細(xì)胞膜修復(fù)的過程出現(xiàn)循環(huán)反復(fù)。只有增加細(xì)胞間縫隙連接,超負(fù)荷電流才能迅速釋放,不會出現(xiàn)細(xì)胞膜擊穿。最終誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接增加,電阻降低,形成固定的潛在電流通路,降低了臨近神經(jīng)元同步放電的閾值。當(dāng)癇性電流[2]出現(xiàn)時,就沿著固定的通路擴(kuò)布。這也正是為什么癲癇的發(fā)作形式眾多,但是每一個具體患者的發(fā)作形式總是相對刻板的原因?？p隙連接異常增多,形成固定的低電阻電流通道是癲癇形成的重要條件。

在癲癇形成的過程中出現(xiàn)的Cx43過度表達(dá)是癲癇形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。過度表達(dá)的縫隙連接蛋白在細(xì)胞膜上組成縫隙連接,形成固定的潛在電流通路。抑制縫隙連接蛋白過度表達(dá),阻斷異常縫隙連接,癲癇形成也受到抑制?？p隙連接蛋白和異?？p隙連接是今后癲癇預(yù)防與治療的一個有效靶點(diǎn)。

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