響應(yīng)面法優(yōu)化核桃ACE抑制肽的制備工藝研究

朱振寶， 周慧江， 易建華， 段光慧

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

目前，全球大約有四分之一的高血壓患者，預(yù)防和治療高血壓病是當(dāng)今社會(huì)十分重要的 課題[1].血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(AngiotensinⅠ-Converting Enzyme，ACE)在血壓調(diào)節(jié)中起著重要作用.目前用于降血壓的藥物中，通過抑制ACE的活性是其中一個(gè)重要途徑[2,3].近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)天然ACE抑制劑的研究報(bào)道較多，目前已經(jīng)從多種動(dòng)植物蛋白及下腳料中分離出多種降血壓肽，采用的工藝技術(shù)主要包括從發(fā)酵食品中分離提取、從自溶產(chǎn)物中提取以及從蛋白質(zhì)水解物中提取等[4].已有報(bào)道通過蛋白酶解酪蛋白、大豆蛋白、小麥胚芽蛋白、玉米蛋白、花生蛋白等[5-8]制備ACE抑制肽.

核桃蛋白屬優(yōu)質(zhì)蛋白[9]，含人體必需的8種氨基酸，據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)SDS-PAGE電泳圖譜進(jìn)行分析的結(jié)果表明[10]，核桃蛋白是由兩條多肽鏈緊密結(jié)合而構(gòu)成的，其中一條肽段的相對(duì)分子質(zhì)量是43～67 KDa，另一條為32～35 KDa，分子質(zhì)量較小，有利于酶解的進(jìn)行.目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于核桃ACE抑制肽的研究較少，本文探索了ACE抑制肽的制備工藝，為核桃ACE抑制肽的產(chǎn)業(yè)化及其構(gòu)效關(guān)系提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃分離蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制，純度為80.1%；中性蛋白酶(Neutrase 0.8 L，0.8 AU/g)，丹麥諾維信(Novo)公司； ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，來源于兔肺)， HHL(馬尿酰-組胺酰-亮氨酸)、馬尿酸，購(gòu)自Sigma公司；乙腈、三氟乙酸，色譜純；其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常見分析純級(jí).

1.2 主要儀器與設(shè)備

PB-10型精密酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；501 A型超級(jí)恒溫器，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司； JBZ-14H型磁力攪拌器，上海大浦儀器有限公司； KDN-04C型凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；德國(guó)ALPHA1-2/LD-2型冷凍干燥機(jī)；Wates 600 高效液相色譜儀 ，Waters公司.

1.3 核桃分離蛋白的酶解

稱取一定量核桃分離蛋白，加無CO2水配制成一定濃度的溶液，迅速升溫至85 ℃滅酶20 min，冷卻至室溫后，調(diào)節(jié)至一定pH值，加入一定量的Neutrase 0.8 L，充分混勻，置于超級(jí)恒溫器中，調(diào)節(jié)溫度開始反應(yīng)，酶解過程中用pH-stat法(不斷加入0.5 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液維持體系pH值，記錄所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積)實(shí)時(shí)測(cè)定水解度(degree of hydrolysis，DH).酶解一定時(shí)間后，將酶解液煮沸2 min滅酶，冷卻至室溫后，調(diào)至中性，10 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液濃縮，凍干.

1.4 ACE抑制活性的測(cè)定

ACE抑制活性參考Cushman等[6，11]的方法并作了改動(dòng)，稱取凍干的核桃多肽粉末，溶解于硼酸鹽緩沖溶液中(pH 8.3，0.1 mol/L，其中含0.3 mol/L的NaCl)，取10μL樣品溶液加入10μLACE(溶于上述相同的緩沖液，0.1 UN/mL)置于漩渦混合儀上使之充分接觸，37℃預(yù)熱10 min，加入50μL 5 mmol/L的HHL(溶于相同的緩沖溶液中)，37 ℃反應(yīng)30 min后，立即加入100μL1 mol/L的HCL溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫，取20μL反應(yīng)物進(jìn)樣，通過RP-HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量，同時(shí)做空白和對(duì)照，以硼酸-硼砂緩沖液代替待測(cè)樣品.

式中：c-ACE抑制劑不參與反應(yīng)的色譜峰面積；b-ACE不參加反應(yīng)的空白峰面積；a-ACE和ACE抑制劑都參與反應(yīng)的色譜峰面積.

色譜條件如下：色譜柱：DiamonsilTM C18柱(4.6×250 mm)；紫外檢測(cè)器：波長(zhǎng)228 nm；流動(dòng)相：A 25%乙腈，流動(dòng)相B：75 %超純水(含0.1 %TFA)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)時(shí)間：20 min.

1.5 核桃蛋白酶解的單因素試驗(yàn)

分別以不同的酶解溫度、酶解pH、底物濃度，酶與底物比及酶解時(shí)間為單因素，考察各因素對(duì)核桃蛋白水解度和ACE抑制率的影響.

1.6 核桃蛋白酶解的響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定對(duì)水解度(DH)和ACE抑制率綜合影響較大的3個(gè)主要因素：溫度(X1)、pH值(X2)、酶與底物比(X3)為自變量，根據(jù)二次回歸中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面Central-Composite，以核桃蛋白水解物的DH和ACE抑制率為響應(yīng)值，進(jìn)行酶解核桃蛋白條優(yōu)化試驗(yàn).數(shù)據(jù)處理和回歸分析采用Design Expert (Version 8.0.5)軟件進(jìn)行，對(duì)核桃ACE抑制肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)DH和ACE抑制率的影響

底物濃度2 %，酶與底物比為3 %，pH 7.0，50℃下恒溫酶解，改變酶解時(shí)間，考察其對(duì)DH和ACE抑制活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

圖1 酶解時(shí)間對(duì)DH和ACE抑制率的影響

從圖1中可以看出，DH從0 h到2 h內(nèi)增加較快，然后從2 h直到3 h內(nèi)增長(zhǎng)緩慢，ACE抑制活性從0 h到2 h隨之增加，但從2 h至3 h卻有所下降.這說明在2 h后隨著水解時(shí)間的增加，ACE抑制活性有下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)锳CE抑制肽被進(jìn)一步降解成了游離氨基酸或者沒有活性的片段，從而降低ACE抑制活性，這一結(jié)論與Mullally等[12]發(fā)現(xiàn)的ACE抑制活性在最初酶解時(shí)間增加，隨著進(jìn)一步水解并未導(dǎo)致抑制活性增加的結(jié)論是一致的.同時(shí)這也說明酶解時(shí)間對(duì)DH和ACE 抑制活性的影響較為明顯，因此，選定2 h為最佳酶解時(shí)間.

2.1.2 酶解溫度對(duì)DH和ACE抑制率的影響

底物濃度2 %，酶與底物比為3 %， pH 7.0，改變酶解溫度分別為(40、45、50、55和60 ℃)考察酶解溫度對(duì)水解度DH和ACE抑制活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 酶解溫度對(duì)DH和ACE抑制率的影響

從圖2中可以看出，隨著酶解溫度的升高，核桃蛋白的DH先迅速增加后有緩慢下降，從5.77 %增大到8.43 %左右，之后又減小為7.83 %左右，這表明Neutrase酶的最適酶解溫度大約為50℃，這符合酶的作用規(guī)律，與李建杰等[13]的研究結(jié)論基本一致.而隨著酶解溫度的升高，ACE抑制率的變化表現(xiàn)為先上升(40～55 ℃)后下降(55～60 ℃)的趨勢(shì)，其原因可能在于隨著DH增大，部分ACE抑制劑被降解，從而引起活性降低.為了得到活性較好的產(chǎn)物，酶解必須要控制適當(dāng)?shù)腄H和較高的ACE抑制率，因此選定50 ℃為酶解合適溫度.

2.1.3 酶解pH對(duì)DH和ACE抑制率的影響

酶解pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，底物濃度2%，酶與底物比為3 %，50 ℃下恒溫酶解2 h，考察酶解pH對(duì)水解度DH和ACE抑制活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

圖3 酶解pH對(duì)DH和ACE抑制率的影響

從圖3中可以看出，pH從5.5增大到7.5，DH基本上一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從5.37 %增大到8.30 %左右，而隨著pH的變化，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性從75 %下降至65 %左右，說明pH對(duì)蛋白的酶解影響很大，這也說明ACE抑制活性與DH并不呈正相關(guān)關(guān)系，在制備ACE 抑制劑肽過程中，不是DH越大，其ACE 抑制活性就越高，而是可能存在一個(gè)最佳的水解度.酶解體系的pH直接影響酶及蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)，只有在特定的pH條件下，酶及蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)才能處于最易于結(jié)合并轉(zhuǎn)產(chǎn)物的解離狀態(tài).綜合考慮較高的DH和ACE抑制率，因此，選擇pH 7.0作為合適的酶解pH.

2.1.4 底物濃度對(duì)DH和ACE抑制率的影響

底物質(zhì)量濃度分別為1%、2%、3%、4%和5%，酶與底物比為3%，pH 7.0，50℃下恒溫酶解2 h，考察酶解底物質(zhì)量濃度對(duì)水解度DH和ACE抑制活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.

圖4 底物濃度對(duì)DH和ACE抑制率的影響

從圖4中可以看出，與其他因素相比，底物濃度對(duì)DH的影響相對(duì)較小，當(dāng)?shù)孜餄舛葟?%～2%時(shí)，其水解度從6.17 %增大到8.36%，當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大至5%，其DH幾乎保持不變，其原因可能是在酶一定量的情況下，底物已經(jīng)全部飽和，因此繼續(xù)增加底物濃度，已經(jīng)對(duì)酶解過程影響較小.同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)，其ACE 抑制活性先上升后下降繼而又小幅上升的趨勢(shì)，其原因可能在于DH不同，從蛋白質(zhì)中釋放的活性肽片段數(shù)量和分子量分布不同，從而影響其ACE抑制活性.綜合考慮到選擇較大DH和較高ACE 活性，因此，選擇底物濃度為2%.

2.1.5 酶與底物比對(duì)DH和ACE抑制率的影響

圖5 酶與底物比對(duì)DH和ACE抑制率的影響

酶與底物比分別為1%、2%、3%、4%和5%，底物濃度2%，pH 7.0，50 ℃下恒溫酶解2 h，考察酶與底物比對(duì)水解度DH和ACE抑制活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.從圖5中可以看出，隨著E/S從1%增大至5%，DH基本上一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從5.47 %增大到8.57 %左右，而隨著E/S的變化，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)E/S從1%增大至3%時(shí)，ACE抑制活性從54.18 %增大到 67.32%，當(dāng)E/S繼續(xù)增大至5%時(shí)，ACE抑制活性從67.32 %下降到 58.79%，原因可能在于大量的酶引起大量的蛋白質(zhì)水解，從而降低了ACE抑制活性.考慮成本和高ACE抑制活性，選擇E/S為3%為合適的酶底比.

綜合以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)Neutrase酶解核桃分離蛋白的DH影響較大的因素有溫度、pH、E/S.酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性隨DH的改變而改變，但其并未與DH表現(xiàn)出可預(yù)知的對(duì)應(yīng)關(guān)系.酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性較高的酶解工藝條件為：酶解時(shí)間2 h，酶解溫度50 ℃、酶解pH 7.0、底物濃度2%、E/S 3%.

2.2 響應(yīng)面(RSM)法設(shè)計(jì)優(yōu)化Neutrase酶解工藝

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選定3個(gè)主要因素：溫度(X1)、pH值(X2)、E/S(X3)對(duì)Neutrase 0.8 L酶解核桃蛋白的工藝進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1.

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的因素和水平

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 響應(yīng)面模型的建立

以DH (Y1)和ACE抑制率 (Y2)為響應(yīng)值，各因素及其交互作用為自變量，采用design expert 8.0.5軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸方程.

Y1= -84.12+0.70X1+19.62X2

+1.26X3-0.06X1X2+0.05X1X3

-0.29X2X3-3.89X12-1.06X22

-0.25X32

(1)

Y2= -126.60+6.97X1+12.28X2-8.80X3

-0.39X1X2+0.15X1X3

+2.66X2X3-0.04X12

-0.40X22-2.96X32

(2)

式中：Y1-響應(yīng)值水解度DH；Y2-響應(yīng)值水解度ACE抑制率；X1-溫度的編碼值；X2-pH的編碼值；X3-酶底比(E/S)編碼值.

對(duì)回歸方程做顯著性檢驗(yàn)與方差分析，方差分析結(jié)果見表3.結(jié)果顯示：DH模型的F值為43.19，P<0.000 1，表明該模型顯著性極好，ACE抑制率模型的F值為4.50，P<0.05，表明該模型顯著性也較好.從表3結(jié)果中P值可知，各個(gè)因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交叉作用對(duì)DH影響都較顯著，而只有溫度和pH的一次項(xiàng)對(duì)ACE抑制率影響顯著.同時(shí)由表3中F值的檢驗(yàn)還可知各因素對(duì)核桃蛋白DH影響的大小順序?yàn)椋篨2(pH)>X3(E/S)>X1(溫度)；對(duì)ACE抑制率的影響順序?yàn)椋篨2(pH)>X1(溫度)>X3(E/S).

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)曲面，結(jié)果如圖6所示，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析溫度、pH值、E/S對(duì)DH的影響.DH隨著E/S、溫度和pH值的升高而緩慢升高.各因素的交互作用對(duì)ACE抑制率的影響不顯著，因此響應(yīng)圖未給出.但是隨著酶解溫度的升高和E/S的增大，ACE抑制率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，而隨著pH的增大，ACE抑制率呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致.

圖6 各因素交互效應(yīng)的響應(yīng)曲面圖

通過軟件對(duì)回歸方程模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，預(yù)測(cè)出最適酶解條件即：溫度55℃，pH 6.81，E/S 3.43 %，在此條件下理論預(yù)測(cè)酶解核桃蛋白的DH為8.43 %，ACE抑制率為68.07 %.

對(duì)優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果所得的DH為8.52 %，ACE抑制率為67.94 %，與理論預(yù)測(cè)值接近，此試驗(yàn)說明響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)是可信的.

表3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

續(xù)表1

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Neutrase 0.8 L酶解核桃分離蛋白工藝分別作了經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化，得到了核桃分離蛋白酶解各因素變量的二次方程，該模型回歸顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合良好，具有一定的應(yīng)用價(jià)值.并在此擬合方程基礎(chǔ)上確定其最佳酶解工藝優(yōu)化條件為：酶解溫度55 ℃，pH 6.81，E/S 3.43%，底物濃度2%，酶解2 h，理論預(yù)測(cè)酶解核桃蛋白的DH為8.43 %，ACE抑制率為68.07 %.在此條件下，驗(yàn)證試驗(yàn)表明，最大DH為8.52%，最大ACE抑制率為67.94%.

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