豬皮明膠肽抗小鼠外周肌肉疲勞作用的研究

董文賓， 張小強(qiáng)， 張 閩

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

近年來，開發(fā)功能性食品應(yīng)用營養(yǎng)手段延緩疲勞和促進(jìn)疲勞恢復(fù)成為運(yùn)動醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[1].在西醫(yī)藥方面，補(bǔ)充能源物質(zhì)、消除代謝產(chǎn)物、使用強(qiáng)壯劑成為主要的預(yù)防與恢復(fù)手段[2].但在實踐應(yīng)用中很少有人研究如何根據(jù)不同運(yùn)動強(qiáng)度的生理學(xué)疲勞特點(diǎn)對應(yīng)實施抗疲勞措施，往往出現(xiàn)盲目用藥，大家同吃一種營養(yǎng)品的現(xiàn)象，不僅影響機(jī)體恢復(fù)，甚至影響身體機(jī)能[3].由于脫離了運(yùn)動性疲勞的具體實際，影響了用藥的范圍和準(zhǔn)確性.

明膠兼具蛋白質(zhì)和高分子材料雙重特性[4-6].一方面具有保水、粘結(jié)、被膜等特性，可以使頭發(fā)、指甲、皮膚健美，被廣泛用于化妝品工業(yè)； 由于它的速溶性, 高相容性和低過敏性，是藥物體系最理想的組分,適合于作為藥劑的填充料，近年還被用作細(xì)菌培養(yǎng)基、血漿代用品、菌苗穩(wěn)定劑等.此外能與單寧酸交聯(lián)而凝聚, 并吸附周圍的渾濁物質(zhì)從而使液體澄清，是一種用途廣泛的天然生物材料.另一方面它是一種蛋白質(zhì),體內(nèi)氧化產(chǎn)生較少的熱能、可防止肥胖病, 被開發(fā)為減肥食品.但是由于缺乏色氨酸，必須氨基酸種類不全，在食品行業(yè)很少作為蛋白源生產(chǎn)活性肽[7].本研究擬通過分析明膠肽對不同強(qiáng)度運(yùn)動負(fù)荷導(dǎo)致外周疲勞的改善功效，以期對明膠肽抗疲勞的相關(guān)研究提供理論和實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

KM封閉群無菌型小白鼠(6周齡)，購自西安交通大學(xué)動物試驗中心，50只，22～26 g.

1.1.2 試驗食品與設(shè)計

食品級明膠(山東淄博寶恩生物科技有限公司提供)，木瓜蛋白酶(北京奧博星生物科技有限公司)，明膠肽(自制，用木瓜蛋白酶水解明膠，酶解工藝條件：pH6.2，酶含量為4%，原料的質(zhì)量濃度為4%，水解溫度51 ℃ ，時間5 h)，全血乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、肝(肌)糖原試劑盒、ATP含量測定試劑盒、超微量ATP酶測試盒(南京建成生物技術(shù)研究所)，其余試劑為分析純.

1.1.3 儀器與設(shè)備

PHS-3C型臺式PH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實業(yè)有限公司)；TCL-16G型臺式離心機(jī)(江蘇省金壇醫(yī)用儀器公司)；JA5103N型電子天平，F(xiàn)SH-2型高速勻質(zhì)器，722N型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；其余為常規(guī)儀器.

1.2 方法

1.2.1 小白鼠分組飼養(yǎng)和運(yùn)動訓(xùn)練

按照體重進(jìn)行隨機(jī)分組，共分成4個組，一個對照組和3個試驗組.且每組要多養(yǎng)2～3只預(yù)防灌胃或者運(yùn)動訓(xùn)練時溺水發(fā)生意外.日常自由采食飲水，灌胃飼養(yǎng)35 d，灌胃時間安排在運(yùn)動前2 h,對照組灌胃雙重蒸餾水，試驗組給予明膠肽，飼養(yǎng)量為動物體重的3%.每天游泳訓(xùn)練一次，每次20 min,水溫30±2 ℃，不負(fù)重.

1.2.2 負(fù)重游泳時間的測定

末次灌胃2 h后，安排對照組小鼠負(fù)重3%，三個試驗組分別負(fù)重3%，4%，5%進(jìn)行游泳運(yùn)動，負(fù)重方式應(yīng)用食品包裝膜包裹橡皮泥，再用棉線系在小鼠尾部的模式，放入深50 cm、恒溫30±2 ℃ 的水中，待其頭部沉入水中6 s不能自己浮出水面為游泳終點(diǎn)，記錄游泳時間.

l.2.3 血乳酸、血尿素氮、肝肌糖原含量的測定

負(fù)重游泳疲勞后，分別采取血樣和組織樣品，按照衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督司1996年頒布的“保健食品的功能學(xué)評價程序和檢驗方法”進(jìn)行檢測[8].采樣和分析方法具體如下：(1)全血的取樣：運(yùn)動后休息30 min, 用暖風(fēng)機(jī)烘干小鼠，頸動脈采血，肝素鈉12 500單位稀釋30倍抗凝，高速離心機(jī)分離，取上清液，按照試劑盒操作說明測試血乳酸和尿素氮；(2)組織采樣：組織采樣在采血后進(jìn)行，將小鼠放在粗糙的平面上，左手向下按壓頸椎，右手拉住小鼠尾部向后上方拉使頸椎脫臼處死小鼠(考慮化學(xué)麻醉導(dǎo)致組織留存較多血液，同時檢測指標(biāo)受化學(xué)試劑干擾影響測試結(jié)果，避免化學(xué)麻醉處死)，在冰面上解剖后剝離取前(后)肢和肝臟, 經(jīng)冰凍生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，加TCA 5%三氯乙酸沉淀蛋白，按照試劑盒操作說明測試肝肌糖原，小鼠組織蛋白質(zhì)含量的測定采用雙縮脲法；(3)樣本的后處理：組織勻漿時選擇小刀，肝臟控制轉(zhuǎn)速3 000 r/min,時間為10 min；肌肉控制轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，時間為15 min.離心機(jī)轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時間15 min，取上清液測試.

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠肽對小鼠體重的影響

小鼠購買后隨機(jī)分組.對照組平均23.37 g,方差0.91；實驗1#組平均24.15 g，方差0.93；2#組平均24.2 g,方差0.86；3#組平均24.1 g,方差0.89.灌胃飼養(yǎng)35 d后, 對照組平均30.8 g,方差1.37；實驗1#組平均31.2 g，方差1.41；2#組平均31.5 g,方差1.56；3#組平均31.3 g,方差1.27.試驗組小鼠體重和對照組比較無明顯差異(P<0.05).說明明膠肽對小鼠體重?zé)o顯著影響.

2.2 對小鼠游泳時間的影響

游泳時間的長短可以直接反映機(jī)體在運(yùn)動中的耐力，是抗疲勞能力的直接表現(xiàn).表1 實驗數(shù)據(jù)表明: 試驗組1#小鼠的游泳時間較對照組游泳時間增加了31.96%，明顯高于對照組(P< 0.05)，差異顯著.由此證實明膠肽具有明顯的抗疲勞功效.2#、3#實驗組雖然游泳時間和對照組相比無明顯差異，但負(fù)重均高于對照組.證實小鼠力量素質(zhì)得到有效提高，而力量素質(zhì)的提高也是動物抗疲勞能力增強(qiáng)的有力表觀.

表1 明膠肽對小鼠游泳時間的影響(x±s，n=10)

2.3 對小鼠血乳酸和尿素氮含量的影響

小鼠在進(jìn)行大強(qiáng)度劇烈運(yùn)動中會產(chǎn)生乳酸，乳酸是無氧條件下機(jī)體糖酵解供能體系的終產(chǎn)物，初期產(chǎn)生乳酸主要由于生理惰性，內(nèi)臟器官機(jī)能動員依靠激素調(diào)節(jié)，是一種化學(xué)信號傳遞模式，而運(yùn)動器官是電信號傳遞，信息傳遞速度快；后期主要由于氧虧積累.乳酸的增加將導(dǎo)致肌肉中H+濃度上升，pH值下降，促使肌肉突觸后膜超極化、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)受阻、肌動蛋白和肌球蛋白結(jié)合與分離受限等，進(jìn)而引起一系列生化變化，給動物機(jī)體帶來延遲性酸痛等不適癥狀，降低機(jī)體的運(yùn)動能力.因此乳酸的產(chǎn)生和積累是導(dǎo)致運(yùn)動性外周疲勞產(chǎn)生的重要原因.乳酸在肌肉中堆積越多，疲勞的程度就越嚴(yán)重.機(jī)體中乳酸積累的程度取決于乳酸產(chǎn)生與清除的速率，那么運(yùn)動性疲勞程度即與乳酸產(chǎn)生與清除的速率緊密相關(guān).乳酸含量增加越少，可證明機(jī)體的抗疲勞能力越強(qiáng)，同時乳酸的消除量有利于疲勞的恢復(fù).由表2可知，運(yùn)動后小鼠試驗組的血乳酸含量與對照組比較分別降低了8.77%、29.78%、30.60%，負(fù)重3%差異顯著(P<0.01) ，負(fù)重4%，5%組均有顯著差異(P<0.05).證實明膠肽可以減少乳酸的增加量，同時亦可能有利于乳酸的消除.

從生化角度來說，高強(qiáng)度長時間運(yùn)動后, 糖原消耗嚴(yán)重，血糖含量明顯降低，難以滿足運(yùn)動對能量的要求.為了滿足大負(fù)荷運(yùn)動能量的需求，運(yùn)動后期機(jī)體將分解蛋白質(zhì)，以滿足連續(xù)運(yùn)動的需求，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化供能比例增加.氨是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物,引起血尿素氮含量會升高.在肌肉中氨主要是以胺離子存在，一方面它可以增加磷酸果糖激酶的活性，從而提高糖酵解的活性，使肌肉中丙酮酸和乳酸增多.另一方面胺離子可抑制檸檬酸脫氫酶的活性，從而降低有氧氧化過程，不利于有氧代謝和糖異生過程，這些都是導(dǎo)致疲勞和影響疲勞消除的因素.此外，日本帝冢山大學(xué)和英國牛津大學(xué)的醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn), 色氨酸是引起CFS 的原因.色氨酸被過多地攝入到腦內(nèi)后, 就會抑制全身的行動，使動物陷于疲勞狀態(tài).本次試驗發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠血清尿素氮含量較對照組有顯著降低(P<0.05)，證實明膠肽有可能通過改善機(jī)體能量供給，減少了通過蛋白質(zhì)等含氮化合物的分解代謝功能，使血清尿素氮含量相對降低，產(chǎn)生抗外周疲勞的功效.

2.4 對小鼠肝(肌)糖原的影響

肝肌糖原是機(jī)體糖類儲存最重要形式，而糖是各種運(yùn)動最主要能源物，它們的含量高低可直接影響機(jī)體的運(yùn)動耐力.

表2 明膠肽對小鼠血乳酸和尿素氮含量的影響(x±s，n=10)

表3 明膠肽對小鼠肝(肌)糖原含量的影響(x±s，n=10)

由表3可知，明膠肽灌胃飼養(yǎng)小鼠可能通過提高動物肝肌糖原的合成速度，促進(jìn)了肝肌糖原的積累；而肝肌糖原是運(yùn)動中所消耗血糖的來源，肝肌糖原儲備的增加，就可為機(jī)體提供更多的能源物質(zhì)，以提高運(yùn)動耐力達(dá)到抗疲勞的目的.試驗組肝糖原的含量與對照組比較，分別升高了86.88%、65.00%、14.38%，差異顯著(P<0.05) ，尤其是小負(fù)荷試驗組和對照組比較均有極顯著差異(P<0.01).說明小鼠體內(nèi)的能量儲備可以支持其更長時間的運(yùn)動需求，能有效抵抗機(jī)體的疲勞.

3 結(jié)論

(1)豬皮明膠抗疲勞肽具有明顯的提高機(jī)體運(yùn)動耐力和運(yùn)動時間的功效，可以減少乳酸和尿素氮的生成.

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊》中判定標(biāo)準(zhǔn)：“負(fù)重游泳實驗結(jié)果陽性，且血乳酸、血清尿素氮、肝糖原3 項指標(biāo)中任意2 項陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用”.本試驗結(jié)果表明4 項指標(biāo)均為陽性，可以判定明膠活性肽具有抗小鼠運(yùn)動性疲勞的作用，期望本研究能為明膠活性肽在功能性食品(運(yùn)動食品、運(yùn)動飲料等)中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)，對增強(qiáng)運(yùn)動耐力，加快疲勞恢復(fù)產(chǎn)生積極的意義.

(2)明膠肽抗外周疲勞作用位點(diǎn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不明確，作用機(jī)理不清楚，在理論和方法學(xué)上作為抗疲勞功能因子還要做進(jìn)一步研究.

在外周, 如神經(jīng)肌內(nèi)接點(diǎn),肌細(xì)胞膜、橫管、肌質(zhì)網(wǎng)、 線粒體、橫橋等都可能成為疲勞發(fā)生的部位, 業(yè)界稱其為外周疲勞的“位點(diǎn)”[9].此外，線粒體是能量產(chǎn)生的重要場所，線粒體氧化磷酸化是由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈完成的.因此氧化磷酸化能否正常進(jìn)行, 取決于一個關(guān)鍵因素就是線粒體內(nèi)膜是否完整.張勇[10]等人研究證明, 力竭性運(yùn)動后心肌和骨骼肌線粒體內(nèi)膜流動性下降；內(nèi)膜分子動力學(xué)改變； 呼吸鏈ATP酶活性顯著降低；氧化磷酸化偶聯(lián)程度降低.現(xiàn)代運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究也已證明, 機(jī)體內(nèi)源氧自由基對線粒體損傷的重要來源即形成電子漏, 并且與線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低, 加大質(zhì)子回漏有關(guān).張勇[11]等研究結(jié)果表明, 力竭性運(yùn)動誘導(dǎo)線粒體電子漏合成增多與電子傳遞-質(zhì)子轉(zhuǎn)移之間的偶聯(lián)破壞有密切關(guān)系, 其機(jī)制可能是主要影響質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)而破壞電子傳遞-質(zhì)子轉(zhuǎn)移的偶聯(lián).實驗觀察到, 力竭運(yùn)動后肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合體I 十Ⅲ 和Ⅱ + Ⅲ 電子傳遞與質(zhì)子泵出比質(zhì)(H+/e) 均明顯降低, 表明線粒體NADH 呼吸鏈和琥珀酸呼吸鏈的電子傳遞與質(zhì)子泵出偶聯(lián)程度均下降, 影響氧化磷酸化,導(dǎo)致ATP合成減少.相關(guān)的研究[12]還證實酶復(fù)合體活性的改變會降低其質(zhì)子泵功能, 影響質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn).有實驗證明, 線粒體ATP合成活性與線粒體內(nèi)膜外表面質(zhì)子濃度之間有更好的相關(guān)性；并且證明在SMP( 亞線粒體)中,ATP合成與膜表面質(zhì)子更為相關(guān), 進(jìn)而說明表面質(zhì)子是ATP合成的主要驅(qū)動力，故在其它條件沒有改變的狀況下, 質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)目降低, 將導(dǎo)致可轉(zhuǎn)化為△Eh能值減少, 而以熱能形式散失的自由能增加, 即“ 滑脫”或由于脫偶(redox slip)影響ATP的合成.另有一些氧化磷酸化解偶聯(lián)和抑制機(jī)制也已弄明白線粒體H+ATP酶(H+-ATPase) 是氧化磷酸化過程的關(guān)鍵酶.明膠肽從改善主要能源物質(zhì)的儲備到有害代謝終產(chǎn)物生成的減少，整個能源物質(zhì)生成環(huán)節(jié)都發(fā)揮了顯著的功效，但具體抗疲勞作用位點(diǎn)尚不明確，對于線粒體能量生成的改觀機(jī)制缺乏深入理解，抗疲勞作用機(jī)理還需要深入研究.

(3)補(bǔ)充明膠肽增強(qiáng)抗疲勞功效符合現(xiàn)代人的消費(fèi)理念.

現(xiàn)代社會生活節(jié)奏日益加快、工作壓力不斷增大、競爭日趨激烈，亞健康人群越來越多.由于疲勞機(jī)理的不明確性和復(fù)雜性,至今臨床尚無有效的藥物和療法，因此相關(guān)人群只能選擇調(diào)理的方式.隨著物質(zhì)的豐富，消費(fèi)已變得越來越個性化，低卡路里的方便食品的更加普及，減少卡路里、脂肪、碳水化合物和追求“抗老齡化”一樣變得十分重要.在一定程度上，明膠就屬于這一類.它是一種非常有價值的蛋白質(zhì)，既不含膽固醇，也不含糖的特性，而且能夠減少食物中的熱量和促進(jìn)軟骨的新陳代謝，預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎，可以低成本地解決許多問題.

蛋白質(zhì)是人體必需的營養(yǎng)成分之一, FAO/WHO 規(guī)定每人每天應(yīng)攝入蛋白質(zhì)70～75 g. 而我國人民實際攝入量只有65 g,尤其是動物源蛋白質(zhì)攝入嚴(yán)重不足.因此開發(fā)食品蛋白資源, 改善人民膳食結(jié)構(gòu), 提高我國人民蛋白質(zhì)攝入數(shù)量和質(zhì)量是一項十分緊迫的任務(wù).將難于被人體吸收的食品蛋白質(zhì)水解成易于被吸收的多肽是完成上述任務(wù)的關(guān)鍵.從1995年至2010年，發(fā)展中國家對肉類的需求增長了40%以上.明膠作為高蛋白質(zhì)物質(zhì)，是肉類生產(chǎn)過程的副產(chǎn)品，而且可以幾乎無限期的儲藏，由于上述原因?qū)⑹姑髂z工業(yè)變得越來越重要.明膠肽是明膠的水解產(chǎn)物, 與大豆、乳蛋白肽相比缺乏色氨酸，其氨基酸組成有缺陷, 但明膠所特有的氨基酸序列使膠原肽無苦味,因此必將使其獲得廣泛的應(yīng)用.

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