核磁共振技術(shù)在枯草芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

商偉偉，蔡 良，羅 磊，沈加彬，施碧紅

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108）

枯草芽孢桿菌是被美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）及我國(guó)農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌，由其產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)各異的抗菌物質(zhì)有幾十種，主要包括由核糖體合成的肽類抗菌物質(zhì)，非核糖體合成的脂肽類抗菌物質(zhì)，磷脂類，大環(huán)內(nèi)酯類，酚類，多烯類物質(zhì)等［1］。經(jīng)研究其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)多種植物病原菌有抑制作用，能強(qiáng)烈抑制水稻紋枯病菌，稻瘟病菌，炭疽病菌等真菌在農(nóng)作物中的傳播，對(duì)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展有很好的促進(jìn)作用［2］。隨著農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等行業(yè)的發(fā)展，人們對(duì)其產(chǎn)生的具有抗菌活性的天然產(chǎn)物產(chǎn)生了濃厚的興趣，對(duì)這些活性成分結(jié)構(gòu)的鑒定亦顯得日益重要。

核磁共振技術(shù)是天然產(chǎn)物尤其是復(fù)雜化合物結(jié)構(gòu)鑒定與分析研究不可缺少的手段，利用核磁共振波譜可以方便地提供不同分子結(jié)構(gòu)上的細(xì)小差別，包括同分異構(gòu)與立體異構(gòu)化合物。近年來(lái)，NMR被頻繁用于枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的分析與結(jié)構(gòu)鑒定。當(dāng)然分析鑒定枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)需要多種方法結(jié)合使用，并且需要大量的工作和經(jīng)驗(yàn)，本文主要從核磁共振技術(shù)在其中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1 核磁共振技術(shù)的原理

核磁共振（NMR）是電磁波與物質(zhì)相互作用的結(jié)果。其原理是：帶有核磁性的原子核有自旋運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生核磁距，在外加高強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下，吸收射頻輻射，引起核自旋能級(jí)的躍遷產(chǎn)生的波譜即核磁共振波譜。由于分子中不同原子核的化學(xué)環(huán)境是不同的，則將會(huì)有不同的共振頻率，產(chǎn)生不同的共振波譜。記錄下來(lái)這種波譜即可判斷該原子在分子中所處的位置及相對(duì)數(shù)目，對(duì)有機(jī)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

在化合物的結(jié)構(gòu)鑒定及分析中最常用的核磁共振技術(shù)是一維核磁共振氫譜（1H－NMR）和碳譜（13C－NMR），一維核磁共振氫譜主要提供化學(xué)位移、耦合常數(shù)、吸收峰的裂分和積分曲線等。與質(zhì)子相比，13C的化學(xué)位移比1H大得多，譜峰重疊的現(xiàn)象小，碳譜能給出更多的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)解析很有幫助。二維核磁共振譜的應(yīng)用使鑒定結(jié)構(gòu)的結(jié)果更可靠、客觀。二維核磁共振譜又分為同核二維核磁共振譜和異核核磁共振譜。常用的五種二維同核實(shí)驗(yàn)包括：COSY、DQF－COSY、TOESY、NOESY（EXSY）和ROESY，異核二維核磁共振譜主要有碳－氫相關(guān)譜（HSQC）、異核多量子相關(guān)譜（HMQC）、異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）。繼二維譜之后，20世紀(jì)90年代脈沖梯度場(chǎng)（PFG）核磁共振技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，使獲得譜線狹窄、高分辨譜圖成為可能，為快速、準(zhǔn)確得到物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息奠定基礎(chǔ)［3］。

2 核磁共振技術(shù)在枯草芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)研究中的應(yīng)用

關(guān)于枯草芽孢桿菌有效抗菌物質(zhì)的利用與研究主要集中在肽類、脂肽類、磷脂類、大環(huán)內(nèi)酯類、酚類、多烯類物質(zhì)等，尤其是肽類及脂肽類備受關(guān)注［4－5］。

2.1 在抗菌多肽類物質(zhì)研究中的應(yīng)用

抗菌肽是枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的一大類的肽類抗菌物質(zhì)［6］。由革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生的肽類抗菌物質(zhì)一般包括三類：未經(jīng)修飾的肽、含二硫鍵的肽以及含羊毛硫氨酸的羊毛硫抗生素。羊毛硫抗生素因其含有罕見(jiàn)的羊毛硫氨酸（Lan）和甲基羊毛硫氨酸（MeLan）而受到廣泛關(guān)注，按照其結(jié)構(gòu)和功能將其分為兩類：A型羊毛硫抗生素和B型羊毛硫抗生素［7］。

Subtilin是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的典型的A型羊毛硫抗生素，其蛋白結(jié)構(gòu)及相關(guān)基因序列已得到了廣泛的研究。Subtilin是一種陽(yáng)離子的，含有5環(huán)的細(xì)長(zhǎng)型的抗菌肽［8］。據(jù)Stein［9］通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）研 究 其 分 子 量 為 3319.56。Chan 等［10］人 通 過(guò)1H 2D－NMR技術(shù)測(cè)得其初級(jí)結(jié)構(gòu)是由32個(gè)氨基酸組成的抗菌肽，而且通過(guò)NMR波譜的分析還發(fā)現(xiàn)Subtilin是羊毛硫氨酸組成的帶有5個(gè)環(huán)的靈活的分子。這是首次通過(guò)NMR技術(shù)獲得的枯草芽孢桿菌羊毛硫抗生素的NMR數(shù)據(jù)，為其他羊毛硫抗生素的結(jié)構(gòu)鑒定及進(jìn)一步研究多肽類和與之相結(jié)合的物質(zhì)的相互作用提供了重要的參考。Christ等［11］通過(guò)研究枯草芽孢桿菌ATCC 6633的自身免疫蛋白SPaⅠ的C末端分子量為14.9×103序列的1H，15N，13C二維核磁共振信號(hào)波譜歸屬，進(jìn)一步研究SPaⅠ與SPaⅠ／Subtilin復(fù)合體的結(jié)構(gòu)信息，從而在分子水平上了解A型羊毛硫抗生素的自身免疫機(jī)制以及與自身免疫蛋白之間的相互作用方式。實(shí)際上與Subtilin結(jié)構(gòu)上極為相似的還有由枯草芽孢桿菌A1／3所產(chǎn)的Ericin S（分子量3442）和Ericin A（分子量2986）［12］。

Subtilosin A是由枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的B型羊毛硫抗生素，與A型不同，它是球形的由35個(gè)氨基酸組成的大環(huán)肽類抗生素。經(jīng) Marx等［13］通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF－MS）研究其分子量為3399.7。同時(shí)，他們?yōu)榱搜芯科淙S結(jié)構(gòu)，將12mg Subtilosin溶于300 μL DMSO－d6中，進(jìn)行（1H，15N，13C）的 NOESY 和TOCSY二維核磁共振波譜實(shí)驗(yàn)，最后通過(guò)對(duì)其NMR波譜數(shù)據(jù)的分析而確定其三維結(jié)構(gòu)，在分子水平上確定了其分子中非相鄰氨基酸之間的內(nèi)部連接，為后面繼續(xù)研究分子內(nèi)的特殊連接提供了參考。

LC1是枯草桿菌A014的分泌物中分離出的一種抗菌多肽，是由47個(gè)氨基酸組成的多肽抗生素，具有很強(qiáng)的抗水稻的白葉枯致病菌的抑菌活性，邵承華等［14］人應(yīng)用2D－NMR技術(shù)研究了LC1的溶液構(gòu)象，通過(guò)分析其DQF－COSY、TOCSY和NOESY等1H－NMR波譜而識(shí)別了47個(gè)氨基酸殘基，進(jìn)一步分析 NOESY波譜中dαN、dNN、dβN和 dαδ的聯(lián)系完成了序列專一譜峰歸屬，分析出LC1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為伸展構(gòu)象，其中25～31與36～42兩個(gè)氨基酸肽段構(gòu)成反平行β折疊，并有32～35氨基酸肽段形成的β轉(zhuǎn)角相連接，LC1不含或僅含少量α螺旋。通過(guò)其特殊的氨基酸組成推斷LC1的三維結(jié)構(gòu)是一個(gè)以Trp23為中心依靠疏水作用穩(wěn)定的核心和由親水性殘基組成親水表面。

2.2 在脂肽類抗菌物質(zhì)研究中的應(yīng)用

環(huán)脂肽是枯草芽孢桿菌所產(chǎn)抗菌物質(zhì)中的一大類物質(zhì)，由親水的肽片段與親油的脂肪烴組成，是一類新型的生物表面活性劑。它除了具有良好的降低界面表面張力外，還具有抗真菌［15］、抗細(xì)菌［16－17］、抗腫瘤［18］、抗病毒［19］等生物學(xué)功能，在醫(yī)學(xué)上將有良好的應(yīng)用前景。

芽孢桿菌是最先被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生環(huán)脂肽表面活性劑的菌株，也是生產(chǎn)環(huán)脂肽的主要微生物來(lái)源。按環(huán)脂肽的結(jié)構(gòu)可以分為兩大類：第一類是脂肪酸鏈直接參與成環(huán)，即脂肪酸的羧基與肽鏈氨基酸的N－端相連，肽鏈氨基酸的C－端與脂肪酸的β－OH或者β－NH2相連而成為環(huán)脂肽。第二類即脂肪酸鏈不參與成環(huán)，而是通過(guò)自身的羧基與肽鏈氨基酸的N－端相連成為另一類環(huán)脂肽［20］。

Surfactin是由芽孢菌產(chǎn)生的脂肽類高效表面活性劑，可使水的表面張力由72mN／m降到27 mN／m，屬第一類抗菌脂肽，也是抗菌脂肽家族中最典型的代表。surfactin除具有抗真菌和抗細(xì)菌能力外，還具有抗癌，抗病毒，溶血等生物學(xué)活性［21］。因此，科學(xué)家對(duì)環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系非常感興趣。Bonmatin［22］等人使用2D－1HNMR技術(shù)測(cè)得了其 ［Leu4］surfactin和 ［Ile4］surfactin的結(jié)構(gòu)（一般的surfactin第4位為Val），證明此兩種物質(zhì)的表面活性是普通surfactin的兩倍，并通過(guò)分析其疏水殘基在surfactin的三維結(jié)構(gòu)模型中的作用確定了結(jié)構(gòu)與功能間的密切關(guān)系。

Circulocins是枯草芽孢桿菌產(chǎn)的第二類抗菌脂肽。具有良好的抗革蘭氏陽(yáng)性菌活性，由于Circulocins特別的結(jié)構(gòu)其抗菌機(jī)制也不同于一般的抗生素，因此在某種程度上能緩解現(xiàn)在抗生素濫用引起的致病菌的抗藥性問(wèn)題。He等［23］人即使用光譜學(xué)方法研究其基本結(jié)構(gòu)：他通過(guò)高分辨率傅氏轉(zhuǎn)換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)譜技術(shù)確定了circulocin α的結(jié)構(gòu)式為C47H49N9O10，然后通過(guò)13C－NMR和1H－NMR獲得了脂肽中羰基碳，次甲基碳及氨基酸殘基中質(zhì)子的化學(xué)移位的大致歸屬，并利用2D－1H－1H COSY，TOCSY，1H－13C HMBC 和HMQC相關(guān)譜技術(shù)獲得了氨基酸的連接順序，脂肪酸的位置及連接方式，再聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)而最終確定了circulocinα的基本結(jié)構(gòu)。

3 NMR聯(lián)用技術(shù)

枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)為微生物的天然產(chǎn)物，種類復(fù)雜。一般要進(jìn)行發(fā)酵，分離純化，濃縮，精制，最后才能進(jìn)行結(jié)構(gòu)的鑒定。其間過(guò)程復(fù)雜，損失嚴(yán)重。與NMR技術(shù)相關(guān)的聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)為解決以上問(wèn)題帶來(lái)了福音。

高效液相色譜－核磁共振波譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC－NMR）是目前天然產(chǎn)物分析鑒定的新手段［24］。其優(yōu)點(diǎn)是可以將HPLC分離的化合物直接進(jìn)行NMR測(cè)定，NMR譜圖可以提供化合物結(jié)構(gòu)的精確信息，從而解決傳統(tǒng)分析方法的一些難題，但是LC－NMR聯(lián)用技術(shù)也存在著一些新問(wèn)題，如LC和NMR的接口技術(shù)難題、溶劑峰抑制、靈敏度很低等。盡管如此該項(xiàng)技術(shù)由于可以避免不必要的分離步驟而獲得復(fù)雜提取物的初步信息，對(duì)于復(fù)雜成分可以首先獲得其成分的新穎性和用途，然后再進(jìn)行常規(guī)分離［25］。

高效液相色譜－固相萃?。舜殴舱瘢℉PLC－SPE－NMR）聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)則解決了很多HPLC－NMR聯(lián)用技術(shù)的難題。該項(xiàng)技術(shù)指混合成分經(jīng)HPLC分離，DAD和MS檢測(cè)記錄，固相萃取柱收集吸附，N2氣流吹干，然后再由氘代溶劑洗脫進(jìn)入NMR儀進(jìn)行檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是被分離組分能得到濃縮而提高靈敏度，也可以免除溶劑峰抑制而獲得更高質(zhì)量的圖譜。因此，可以快速識(shí)別已知化合物和進(jìn)行新化合物的結(jié)構(gòu)研究［25］?？莶菅挎邨U菌抗菌物質(zhì)屬于微生物天然產(chǎn)物，種類復(fù)雜多樣，以上聯(lián)用技術(shù)在枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)方面的鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道，但可想而知其應(yīng)用前景廣闊，NMR聯(lián)用技術(shù)對(duì)天然產(chǎn)物的研究也必將產(chǎn)生重大的影響。

4 展望

由于枯草芽孢桿菌所產(chǎn)抗菌活性成分的復(fù)雜性以及NMR技術(shù)自身的技術(shù)特點(diǎn)，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)活性物質(zhì)特別是未知組分的NMR鑒定仍然是一份艱難的、富于挑戰(zhàn)的工作，加上NMR技術(shù)的靈敏度較低，遠(yuǎn)不及質(zhì)譜，都使得NMR的鑒定與圖譜的解析增加很多的困難。因此，NMR聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展變得更為迫切，尤其是 HPLC－SPE－NMR聯(lián)用技術(shù)與HPLC－NMR－MS聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)都給枯草芽孢桿菌活性成分的鑒定提供了希望，隨著NMR技術(shù)的快速發(fā)展以及國(guó)內(nèi)外研究枯草芽孢桿菌活性成分的研究者的不斷地努力，相信一定會(huì)有新的成果。

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