恒細(xì)胞密度發(fā)酵策略提高重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶的表達(dá)效率

王輝林，李江華，劉龍，宋江寧，堵國成,4

1 中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308

2 中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 系統(tǒng)微生物工程中科院重點實驗室，天津 300308

3 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

4 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122

堿性果膠酶 (Alkaline polygalacturonate lyase，PGL，E.C.4.2.2.2) 是一類能在堿性條件下高效分解植物組織中果膠質(zhì) (由 D-半乳糖醛酸以 α-1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物) 的酶的總稱[1]。它是紡織用酶的一種，主要應(yīng)用于棉織物的生物精煉，除去棉纖維中的果膠等雜質(zhì)。與傳統(tǒng)高能耗、高污水排放的堿處理法相比，酶處理法具有條件溫和、環(huán)境友好、低能耗、易實現(xiàn)清潔生產(chǎn)等優(yōu)勢[2-4]，也可提高棉織物的品質(zhì)[5-6]。因此，以堿性果膠酶為主的酶處理法取代傳統(tǒng)高溫高堿的化學(xué)工藝具有重要意義。

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母 (The methylotrophic Pichia pastoris) 從上世紀(jì)70年代被開發(fā)應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)開始，現(xiàn)在已經(jīng)成為研究和使用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一[7]。超過500種重組蛋白在畢赤酵母中表達(dá)成功[8]，外源蛋白表達(dá)水平可達(dá)到胞外蛋白的80%或總蛋白的30%[9]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的改造及高效表達(dá)是目前生化工程研究的熱點[10]。表達(dá)系統(tǒng)改造方面，Mehmet Inan等[11]通過過量表達(dá)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，促進(jìn)畢赤酵母翻譯后修飾與胞外分泌。Brigitte Gasser等[12]構(gòu)建生物素原養(yǎng)型畢赤酵母，使發(fā)酵過程不再需要添加生物素。在發(fā)酵優(yōu)化方面，研究主要集中在高密度發(fā)酵、誘導(dǎo)條件優(yōu)化、甲醇流加控制策略等方面。雙碳源混合流加、低溫誘導(dǎo)、富氧培養(yǎng)、降低蛋白酶降解作用等也常作為優(yōu)化策略以提高外源蛋白的表達(dá)效率。

本研究室諸葛斌等[13]擴(kuò)增出野生芽胞桿菌Bacillus sp. WSHB04-02的堿性果膠酶編碼基因，并成功表達(dá)于P. pastoris GS115中。王蕓等[14-15]應(yīng)用高密度培養(yǎng)和低溫誘導(dǎo)等策略，使堿性果膠酶產(chǎn)量達(dá)到國際領(lǐng)先水平。但是，高密度發(fā)酵在工業(yè)化放大生產(chǎn)過程中，易出現(xiàn)供氧不足、冷凝水能耗過大、發(fā)酵高粘度、高死亡率和高蛋白酶分泌等問題[16]。這些不利因素容易導(dǎo)致生產(chǎn)失敗。在3 L和30 L發(fā)酵罐中，PGL的產(chǎn)量可分別達(dá)到890 U/mL和1 425 U/mL。但是，在5 t工業(yè)發(fā)酵罐進(jìn)行放大后，酶活僅為504 U/mL[16]。因此，為了進(jìn)一步提高 PGL的生產(chǎn)強(qiáng)度并尋找適合于工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵新模式，本文系統(tǒng)研究了細(xì)胞密度對重組畢赤酵母分批補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn) PGL的影響，并發(fā)展出恒細(xì)胞密度發(fā)酵表達(dá)PGL的新策略。

1 材料與方法

1.1 菌種

宿主為P. pastoris GS115，同時具有Mut+和的His+表型，整合了來自Bacillus sp. WSHB04-02中的PGL基因，拷貝數(shù)為2~3個，本實驗室保藏[13]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 YPD種子培養(yǎng)基

1%酵母膏(Yeast extract)，2%蛋白胨(Peptone)，2%葡萄糖(Glucose)。

1.2.2 甘油分批發(fā)酵培養(yǎng)基 (Batch media)

甘油 (Glycerol) 40.0 g/L，K2SO418.2 g/L，CaSO40.93 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，85% H3PO426.7 mL/L，KOH 4.13 g/L，微量元素溶液(PTM1)[16]4.35 mL/L，115 ℃滅菌15 min，再用25% NH4OH調(diào)pH至5.5。

1.2.3 甘油補(bǔ)料生長培養(yǎng)基

含12 ml/L PTM1的 50% (W/V) 的甘油溶液。

1.2.4 發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基

分批補(bǔ)料誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的100%甲醇溶液 (分析純) 。

連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：w1% (W/V) CCM (Continuous culture media, 即為5倍含量的 (除甘油、氨水、PTM1外) 的Batch media培養(yǎng)基) + w2% (W/V)甲醇 (分析純) + w3% ( W/V) PTM1，其中w1~w3的值參見3.1.2。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子搖瓶培養(yǎng)

種子甘油管于-80 ℃保藏，從甘油管中接1 mL菌液于50 mL YPD培養(yǎng)基中 (搖瓶裝液量為10%)，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，OD600為8~16。

1.3.2 高密度發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液接入 3 L全自動發(fā)酵罐(LiFlus GM BioTRON, Korea) 中，接種量為10%。初始培養(yǎng)條件為：裝液量800~1 000 mL，起始攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min，通氣量2 vvm。生長階段溫度為30 ℃，采用攪拌關(guān)聯(lián)控制使DO維持在 (30±5)%，攪拌轉(zhuǎn)速最高值設(shè)置為950 r/min。采用30%的磷酸溶液和25%的濃氨水控制pH在5.5。

當(dāng)甘油耗盡時 (DO迅速上升至60%以上)，采用指數(shù)流加方式補(bǔ)加50% (W/V) 的甘油。通過控制指數(shù)流加時間以實現(xiàn)不同誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度。指數(shù)流加結(jié)束后，待甘油再次耗盡，DO再次反彈至60%以上時，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并將誘導(dǎo)溫度降低至22 ℃。通過控制誘導(dǎo)培養(yǎng)基的流加速度，使培養(yǎng)基中甲醇濃度迅速達(dá)到并維持在1.8% (V/V)，此時，F(xiàn)C2002型甲醇檢測流加控制器的甲醇?xì)埩魸舛戎禐?.8% (V/V)。發(fā)酵過程使用發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件自動控制與數(shù)據(jù)采集[16]。

1.4 測定方法

1.4.1 菌體干重的測定

準(zhǔn)確移取10 mL 發(fā)酵液于50 mL離心管中，先經(jīng)過10 000 r/min冷凍離心5 min，棄上清，再用蒸餾水重懸，重復(fù)洗滌離心2次。然后將菌體放在恒溫烘箱105 ℃烘干至恒重。最后，稱量并計算干重 (DCW，g/L)。

1.4.2 堿性果膠酶活性的測定

一個標(biāo)準(zhǔn)酶活單位 (IU) 定義為：每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1 μmol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量[17]。

1.4.3 醇氧化酶AOX活力的測定

取發(fā)酵液放置于干冰中迅速冷凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱中。測定時，將樣品置于冰水中解凍，于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，用50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 7.0) 洗滌2次，再用緩沖液重懸。然后，將重懸菌液進(jìn)行超聲波破碎處理，破碎時間為10 min，再離心收集上清酶液。

AOX測定標(biāo)準(zhǔn)分析混合液 (3 mL)：甲醇200 μmol，4-氨酰安替比林1 μmol，PBS (pH 7.0) 100 μmol，苯酚4.3 μmol，辣根過氧化物酶15 U和稀釋后的待測酶液。反應(yīng)體系于可控溫的UV2450分光光度計 37 ℃下動態(tài)測定吸光度變化斜率，通過公式計算出醌的變化量來表示AOX的酶活力。AOX酶活的定義為：在上述條件下，每分鐘生成1 μmol H2O2需要的酶量[18]。

1.4.4 細(xì)胞活力和出芽率測定

細(xì)胞活性 (或死亡率) 采用臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測試劑盒進(jìn)行檢測。取一定量樣品用50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 7.0) 洗滌2次，再用細(xì)胞稀釋液稀釋重懸。吸取100 μL細(xì)胞懸液到離心管內(nèi)，加入100 μL臺盼藍(lán)染色液，混合均勻，染色3~5 min (時間不宜過長)，然后于血球計數(shù)板計數(shù)。由于健康的酵母細(xì)胞能夠排斥臺盼藍(lán)，臺盼藍(lán)不進(jìn)入細(xì)胞；而死亡的細(xì)胞，喪失膜的完整性，通透性增加，臺盼藍(lán)將細(xì)胞染成藍(lán)色。因此顯微鏡下藍(lán)色細(xì)胞為死亡細(xì)胞，透明細(xì)胞為活性細(xì)胞。為了得到更高的準(zhǔn)確率，每個樣品將進(jìn)行500個細(xì)胞以上的計數(shù)。

另外，每個樣品都測定其出芽率。如果芽體大于母細(xì)胞的一半體積則計為1個細(xì)胞，否則不計為細(xì)胞。

1.4.5 胞外蛋白酶測定

發(fā)酵液經(jīng)過10 000 r/min離心10 min，收集上清液作為待測樣品。胞外的總蛋白酶酶活力采用Pierce Colorimetric QuanticleaveTM的蛋白酶檢測試劑盒進(jìn)行測定[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 控制誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度對分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的影響

高密度發(fā)酵技術(shù)是提高重組畢赤酵母表達(dá)外源蛋白效率的一種重要技術(shù)手段。高密度發(fā)酵能有效地提高目的產(chǎn)物的濃度，降低下游分離純化成本。細(xì)胞密度是畢赤酵母發(fā)酵過程的重要控制參數(shù)，尤其在工業(yè)化放大過程中，基于細(xì)胞密度的放大對于發(fā)酵的成敗至關(guān)重要。因此，在發(fā)酵過程中，控制合理的細(xì)胞密度，對于實現(xiàn)異源蛋白的高效表達(dá)具有重要意義。

根據(jù)王蕓等[20]采用甘油指數(shù)流加方法，實現(xiàn)畢赤酵母生長階段的高密度培養(yǎng)。通過控制甘油的流加，即分別進(jìn)行5 h、9 h、14 h的流加，誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度可分別達(dá)到56.7 g/L、83.4 g/L、124.9 g/L。

在誘導(dǎo)表達(dá)階段，甲醇不但是啟動子(pAOX1) 的誘導(dǎo)劑，也為菌體生長提供碳源和能源。因此，在誘導(dǎo)階段，畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的同時，菌體密度也在不斷增加。如圖1所示，3種不同誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度 (分別為 56.7 g/L、83.4 g/L、124.9 g/L) 誘導(dǎo)120 h后，最終菌體密度分別達(dá)到115 g/L、140 g/L、155 g/L。低誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度發(fā)酵 (56.7 g/L) 的菌體生長最快，比生長速率最高可達(dá)到0.029 h-1。菌體密度影響產(chǎn)品的總收率：發(fā)酵結(jié)束時細(xì)胞密度越高，總上清液與總發(fā)酵液的比例越小，固液分離操作過程中的產(chǎn)品的收率越低。酶液的回收率與發(fā)酵液的細(xì)胞密度呈線性負(fù)相關(guān) (y=-0.0026x+0.999, R2=0.9966，數(shù)據(jù)未顯示)。此外，過高的細(xì)胞密度也加大工業(yè)化后處理的操作困難。

如圖 1D所示，細(xì)胞密度與比生長速率 (μ)密切相關(guān)，菌體密度限制了細(xì)胞生長。μ隨著細(xì)胞密度的增大而下降，當(dāng)細(xì)胞干重達(dá)到130 g/L以上，菌體生長緩慢，μ約為0.008 h-1。而細(xì)胞密度為75 g/L時，μ可高達(dá)0.029 h-1。

在相同的發(fā)酵條件下，增加誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度，發(fā)酵過程的溶氧水平下降。當(dāng)初始菌體濃度為56.7 g/L時，發(fā)酵過程的DO值維持在20%以上。而誘導(dǎo)初始細(xì)胞濃度為83.4 g/L和124.9 g/L時，發(fā)酵過程的DO僅分別為10% (維持在8%~15%) 和5% (維持在3%~6%)。表明這兩種高細(xì)胞密度的發(fā)酵出現(xiàn)了供氧不足的現(xiàn)象。

如圖 1和表 2所示，當(dāng)初始細(xì)胞密度為56.7 g/L，誘導(dǎo)77 h，酶活為691.4 U/mL。而當(dāng)初始菌體密度增加到124.9 g/L，誘導(dǎo)101 h，酶活可達(dá)到961.4 U/mL，比初始菌體密度為56.7 g/L提高了39.1%。但是，初始細(xì)胞密度為56.7 g/L的單位菌體生產(chǎn)強(qiáng)度 (Average specific enzyme production rate，QX) 和單位發(fā)酵液體積生產(chǎn)強(qiáng)度 (PGL productivity，QV) 可分別達(dá)到了44.3 U/(g·h)、5.09 U/(g·h)。該過程的QX值比初始時的 83.4 g/L (35.1 U/(g·h))、124.9 g/L (27.9 U/(g·h)) 分別高出26.2%、58.8%。QV也分別比另外兩種發(fā)酵策略 (4.56 U/(mL·h)、4.30 U/(mL·h)) 高出11.6%、18.4%。QX隨著誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度的升高而下降，說明控制合理細(xì)胞密度發(fā)酵有利于提高QX。

一般來說，利用重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白的發(fā)酵周期較長 (如高密度對照組的發(fā)酵周期為137 h)。而初始細(xì)胞密度為56.7 g/L的發(fā)酵方式的周期比高密度對照組縮短了39 h，發(fā)酵總周期僅為98 h。

2.2 恒細(xì)胞密度發(fā)酵策略動力學(xué)參數(shù)的確定

上述結(jié)論表明，細(xì)胞密度是影響重組畢赤酵母高效表達(dá) PGL的關(guān)鍵因素，合理地控制細(xì)胞密度能有效地提高 PGL的表達(dá)效率。因此，本文進(jìn)一步研究細(xì)胞密度對連續(xù)培養(yǎng)過程 PGL表達(dá)的影響，并提出恒細(xì)胞密度 (Constant cell concentration by methanol feeding，簡稱為CCCM)發(fā)酵策略以提高PGL的表達(dá)效率。

圖1 控制誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度對PGL表達(dá)過程的影響Fig. 1 Time evolution of biomass (Dry cell weight, DCW), dissolve oxygen, PGL activity under different cell concentrations in the prior-induction phase. (A) 56.7 g/L. (B) 83.4 g/L. (C) 124.9 g/L. (D) The relationship between the specific growth rate and biomass.

在誘導(dǎo)階段，傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方式采用流加100%的甲醇，導(dǎo)致誘導(dǎo)階段細(xì)胞密度不斷上升。因此，為了準(zhǔn)確控制誘導(dǎo)階段的細(xì)胞密度，必須調(diào)控甲醇流加的比例。本研究通過分析恒細(xì)胞密度發(fā)酵策略的動力學(xué)方程，并確定了動力學(xué)參數(shù)，使之更好地指導(dǎo)甲醇的流加。在連續(xù)培養(yǎng)過程中，使用25%氨水和30%磷酸調(diào)節(jié)pH，使體系的pH控制在 5.5，氨水和磷酸的補(bǔ)料體積相比甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)基可忽略不計

其中，F(xiàn)為補(bǔ)料流速，F(xiàn)ccm為連續(xù)培養(yǎng)基本補(bǔ)料培養(yǎng)基的流速，F(xiàn)m為甲醇培養(yǎng)基 (含PTM1的甲醇溶液) 的流速，w1、w2(見公式4) 分別為CCM、甲醇補(bǔ)料比例，單位為% (W/V)。D為稀釋率，V為發(fā)酵液體積，μ為比生長速率。w1的值是根據(jù)單位菌體對基本補(bǔ)料培養(yǎng)基 (CCM)的需求量 (本文中每克細(xì)胞干重需1.3 mL CCM培養(yǎng)基)，確定其流加比例。PTM1的添加量參考分批補(bǔ)料流加，即12 mL PTM1/1 000 mL甲醇。

恒細(xì)胞密度發(fā)酵過程，通過控制流加甲醇的速率和比例，使甲醇?xì)埩魸舛染S持在 1.8% (V/V)。因此需要準(zhǔn)確計算出 w2的預(yù)期值，以實現(xiàn)恒細(xì)胞密度培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵過程不考慮細(xì)胞維持系數(shù)，則：

式 (3) 中，wt為培養(yǎng)基中甲醇的殘留濃度，即為1.8% (V/V)。在畢赤酵母高密度發(fā)酵的誘導(dǎo)過程中，甲醇不僅為菌體提供碳源；也可被氧化，為細(xì)胞提供能量，維持細(xì)胞的能量代謝。因此，細(xì)胞維持系數(shù)并不可忽略，則：

在恒細(xì)胞密度發(fā)酵過程中，發(fā)酵過程可以分成2個階段，即適應(yīng)期 (Adaption stage) 與穩(wěn)定期 (Stable stage)。在適應(yīng)期，甲醇消耗速度較慢；而在穩(wěn)定期，甲醇消耗速率較快，并趨于穩(wěn)定。通過多次發(fā)酵求解可以得到：

如表1所示，在恒細(xì)胞密度發(fā)酵過程中，w2的計算值與實際控制值極為接近，說明上述動力學(xué)參數(shù)求解值能很好地反應(yīng)發(fā)酵過程的真實情況。因此，可以根據(jù)上述公式和參數(shù)值，計算出恒細(xì)胞密度發(fā)酵過程的甲醇流加方式。

2.3 恒細(xì)胞密度發(fā)酵策略提高堿性果膠酶表達(dá)效率和發(fā)酵適應(yīng)性

2.3.1 恒細(xì)胞密度發(fā)酵對重組畢赤酵母生長與產(chǎn)酶的影響

通過對恒細(xì)胞密度培養(yǎng)的流加策略和動力學(xué)研究，本研究預(yù)設(shè)了3種不同的細(xì)胞密度，分別為DCW 55 g/L、75 g/L和105 g/L。如圖2所示，通過3種不同流加策略實現(xiàn)恒細(xì)胞密度培養(yǎng)，其發(fā)酵過程的細(xì)胞密度都能夠很好地維持在預(yù)設(shè)值。在誘導(dǎo)的適應(yīng)期 (0~10 h)，甲醇代謝途徑的關(guān)鍵酶開始表達(dá)，此時甲醇的利用速率較慢。在穩(wěn)定期 (＞10 h)，甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶維持在相對穩(wěn)定的高水平，甲醇被快速利用，為細(xì)胞生長和代謝提供所需的碳源和能源。與 Fed-batch culture (FBC) 相比，CCCM培養(yǎng)的菌體生長速率更快，穩(wěn)定期的平均 μ值分別達(dá)到 0.018 h-1(DCW 55 g/L)、0.017 h-1(DCW 75 g/L) 和0.012 h-1(DCW 105 g/L)。恒細(xì)胞密度培養(yǎng)穩(wěn)定期的出芽率分別維持在23% (DCW 55 g/L)、21% (DCW 75 g/L) 和17% (DCW 105 g/L)，說明該培養(yǎng)模式下細(xì)胞穩(wěn)定地快速生長。

表1 恒細(xì)胞密度發(fā)酵過程w2流加理論值和實際值的比較Table 1 Comparison of the theoretical and practical values of w2 for methanol feeding in the CCCM culture

由于CCCM策略很好地控制細(xì)胞密度維持在合理水平，氧氣的需求量降低，不同程度地避免了供氧限制，因此該模式下的溶解氧維持在較高水平。CCCMDCW 55 g/L、CCCMDCW 75 g/L和CCCMDCW105g/L的DO值分別為30%、15%和10%。當(dāng)溶解氧小于15%時，預(yù)示著供氧不足，不利于產(chǎn)酶。溶解氧是發(fā)酵過程一個重要的參數(shù)，富氧培養(yǎng)有利于促進(jìn)氧化磷酸化和 ATP的再生，提高外源蛋白表達(dá)效率，促進(jìn)發(fā)酵過程的適應(yīng)性[21]。甲醇代謝途徑有兩條途徑，分別為氧化途徑和生長途徑。氧化途徑需消耗大量的氧氣，最終產(chǎn)生大量的能量。而生長途徑需要的氧氣量較少，甲醇最終轉(zhuǎn)化為生物質(zhì) (如下化學(xué)式[1-2])。CCCM控制相比FBC，耗氧量少 (高DO值)，菌體生長速率快 (高μ值)；說明CCCM策略的甲醇生長途徑比例上升，而氧化途徑的比例降低。因此 CCCM發(fā)酵模式降低了代謝產(chǎn)熱，有利于緩解工業(yè)化冷卻壓力。

根據(jù)C平衡[22]，甲醇代謝途徑：

在CCCM培養(yǎng)中，PGL酶活力隨著細(xì)胞密度的增加而升高，3種控制策略PGL酶活可分別達(dá)到305.9 U/mL、441.9 U/mL和528.7 U/mL，并于誘導(dǎo)45 h后達(dá)到穩(wěn)定水平。如圖2中虛線所示，這表明 CCCM培養(yǎng)過程維持較為穩(wěn)定的產(chǎn)酶速率。

如表2所示，相比于FBC，雖然CCCM培養(yǎng)方式的最終酶活力較低，但是該發(fā)酵策略的生產(chǎn)強(qiáng)度更高。在CCCM培養(yǎng)中，QX值隨著細(xì)胞密度的增加而降低，特別是當(dāng)細(xì)胞密度大于75 g/L。CCCMDCW55g/L和CCCMDCW75g/L的QX分別高達(dá) 84.5 U/(g·h) 和 81.5 U/(g·h)，比CCCMDCW105g/L高出85.7%和79.1%，也分別比分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵策略 (FBCDCW124.9g/L) 提高了202.9%和192.1%。相比于不控制細(xì)胞的傳

統(tǒng)發(fā)酵方式 (FBCDCW 56.7 g/L和FBCDCW 83.4 g/L)，

圖2 恒細(xì)胞密度發(fā)酵過程曲線Fig. 2 Time evolution of dissolve oxygen, biomass (Dry cell weight, DCW), budding rate and PGL activity using CCCM culture with different cell concentrations in the post-induction phase. The dash lines are the expectant values of PGL activity in CCCM cultures. (A) 55 g/L. (B) 75 g/L. (C) 105 g/L.

表2 兩種不同發(fā)酵策略表達(dá) (Fed-batch culture和CCCM culture) PGL過程參數(shù)的比較Table 2 Comparison of parameters in PGL production by the recombinant P. pastoris during fed-batch culture and constant cell concentration cultrures by methanol feeding (CCCM cultures)

這兩種發(fā)酵過程的 QX值也分別高出 90.7%和 132.2%。在限定的發(fā)酵條件下，高密度培養(yǎng)易導(dǎo)致供氧不足并導(dǎo)致生化條件的惡化，影響了外源蛋白的表達(dá)效率。因此，合理控制細(xì)胞密度對于提高發(fā)酵的表達(dá)效率是非常有意義的。另外，從QV方面105 g/L考慮，DCW為75 g/L的CCCM策略的 QV最高，達(dá)到 6.11 U/(mL·h)，比CCCMDCW75g/L、CCCMDCW105g/L高出31.4%、27.8%，也分別比 CCCM 比高密度對照組(FBCDCW124.9g/L) 提高了 42.1%。因此，CCCM發(fā)酵策略有利于提高單位發(fā)酵液體積的產(chǎn)酶效率，既提高了發(fā)酵罐的利用效率，又更好發(fā)揮重組菌的產(chǎn)酶潛力。

綜合考慮以上的各個參數(shù)，如菌體比產(chǎn)酶速率 (QX)、發(fā)酵液單位體積比產(chǎn)酶速率 (QV) 和PGL酶活等，研究認(rèn)為DCW為75 g/L的CCCM培養(yǎng)為最優(yōu)的發(fā)酵策略。

2.3.2 恒細(xì)胞密度培養(yǎng)對AOX酶活的影響

重組P. pastoris表達(dá)外源蛋白受AOX1啟動子 (pAOX1) 調(diào)控，在 Mut+型中，AOX的表達(dá)水平可作為啟動子效率與外源蛋白表達(dá)水平的一個指標(biāo)[23]。如下圖3所示，采用CCCM控制比 FBC的胞內(nèi) AOX表達(dá)量更高，也說明了CCCM發(fā)酵策略的PGL的表達(dá)效率比FBC策略高。CCCMDCW55g/L的平均AOX酶活為180.8 U/L，比FBCDCW56.70g/L的平均AOX酶活77.2 U/L高出1.34倍。CCCMDCW75g/L和CCCMDCW105g/L也

分別比FBCDCW 83.39 g/L和FBCDCW 124.90 g/L的AOX

表達(dá)水平高。AOX是甲醇代謝途徑的第一個酶，因此AOX的高效表達(dá)有利于CCCM培養(yǎng)過程菌體的快速生長。在傳統(tǒng)的分批補(bǔ)料發(fā)酵，AOX酶活在發(fā)酵后期開始下降，特別是誘導(dǎo)90 h后。說明此時菌體的產(chǎn)酶能力下降甚至菌體不產(chǎn)酶。而CCCM發(fā)酵策略穩(wěn)定期的AOX維持在相對恒定的水平，說明菌體處于長期的高效表達(dá)的狀態(tài)。因此，CCCM發(fā)酵模式有利于重組畢赤酵母延長高效產(chǎn)酶的發(fā)酵周期。

2.3.3 應(yīng)用恒細(xì)胞密度發(fā)酵策略提高細(xì)胞活性

圖3 比較兩種不同發(fā)酵策略 (分批補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)培養(yǎng)) 的AOX酶活Fig. 3 Comparison of the AOX activities under two different fermentation strategies in the post-induction phase. (A) CCCM cultures. (B) Fed-batch cultures with different initial cell concentration.

圖4 恒細(xì)胞密度培養(yǎng)的細(xì)胞活性變化曲線Fig. 4 Time evolution of cell viability in the CCCM cultures with different cell concentrations in the post-induction phase.

外源蛋白的表達(dá)效率與細(xì)胞活性密切相關(guān)。傳統(tǒng)畢赤酵母發(fā)酵后期，細(xì)胞活性往往低于70%，說明細(xì)胞承受著各種環(huán)境壓力[24]。甲醇代謝途徑的中間代謝產(chǎn)物 (H2O2、甲酸、甲醛等)對細(xì)胞具有毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。尤其是高密度發(fā)酵，菌體死亡更為明顯，而高死亡率將影響PGL的表達(dá)和穩(wěn)定性。CCCM發(fā)酵策略可以有效地提高酵母細(xì)胞的活性。如圖 4所示，3種不同的恒細(xì)胞密度培養(yǎng)方式維持高的細(xì)胞活性，細(xì)胞存活率都在 92%以上。特別是 DCW 55 g/L和75 g/L的控制策略，存活率在94%以上。相比之下，傳統(tǒng)高密度發(fā)酵的細(xì)胞活力下降很快，誘導(dǎo)120 h后細(xì)胞活性僅為83.8%。CCCM培養(yǎng)實現(xiàn)菌體的高活性，主要的原因可能是：1) CCCM 是一種連續(xù)培養(yǎng)過程，菌體生長速度快，具有高的稀釋率，菌體不斷被更新。一部分衰老和死亡細(xì)胞被洗出，并被新細(xì)胞所取代。CCCM 培養(yǎng)能較好地維持發(fā)酵液新老細(xì)胞的更替。2) 細(xì)胞受到各種壓力脅迫下，容易引起菌體死亡。CCCM培養(yǎng)控制細(xì)胞密度維持在較為合理水平，細(xì)胞受到的由于高密度發(fā)酵引起的壓力得到緩解。因此，細(xì)胞處于較為舒適的外界環(huán)境，死亡率下降。

2.3.4 應(yīng)用恒細(xì)胞密度培養(yǎng)降低胞外蛋白酶的降解作用

胞外蛋白酶對異源蛋白的降解作用，一直是重組畢赤酵母高效生產(chǎn)外源蛋白的難題，尤其是發(fā)酵后期。因此，很多發(fā)酵策略被應(yīng)用于降低蛋白酶的降解作用，如低溫誘導(dǎo)、添加蛋白酶競爭抑制劑等。

CCCM培養(yǎng)具有更高的細(xì)胞活性，降低了細(xì)胞死亡裂解的蛋白酶的釋放水平，因此 CCCM培養(yǎng)的胞外蛋白酶的含量降低。如圖 5所示，DCW為55g/L和75 g/L的CCCM發(fā)酵策略，誘導(dǎo)120 h后，胞外總蛋白酶分別為1.4 mg/L和1.9 mg/L (Pierce QuantiCleaveTMProtease Assay Kit，胰蛋白酶當(dāng)量酶活單位)。而傳統(tǒng)高密度發(fā)酵策略120 h的胞外總蛋白酶達(dá)到12 mg/L。胞外蛋白酶總含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行，不斷積累，特別是發(fā)酵后期尤為嚴(yán)重。過量胞外蛋白酶的存在，不利于發(fā)酵液 PGL的積累，也影響酶的穩(wěn)定性。

3 討論

利用基因工程菌重組表達(dá)堿性果膠酶是該酶最主要的生產(chǎn)方法[25-26]。在前期發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)上，已實現(xiàn)了該酶的工業(yè)化生產(chǎn)[14]。本研究以畢赤酵母表達(dá) PGL為模式，研究了細(xì)胞密度對重組畢赤酵母表達(dá)異源蛋白的影響，并發(fā)展了恒細(xì)胞密度發(fā)酵的新策略。研究表明，細(xì)胞密度是影響 PGL生產(chǎn)強(qiáng)度的一個關(guān)鍵因素。合理地控制細(xì)胞密度能有效地提高 PGL的表達(dá)效率，并提高發(fā)酵的適應(yīng)性。在分批補(bǔ)料培養(yǎng)中，控制合適的誘導(dǎo)初始細(xì)胞密度有利于提高 PGL的生產(chǎn)強(qiáng)度，縮短發(fā)酵周期。恒細(xì)胞密度培養(yǎng)是一種連續(xù)培養(yǎng)過程。相比于傳統(tǒng)的高密度分批補(bǔ)料發(fā)酵，恒細(xì)胞密度發(fā)酵模式極大地提高了單位菌體和單位體積的生產(chǎn)強(qiáng)度。此外，該發(fā)酵策略還具有提高細(xì)胞活性和降低胞外蛋白酶的降解作用等優(yōu)勢。因此，恒細(xì)胞發(fā)酵策略是一種具有潛在價值的重組畢赤酵母工業(yè)規(guī)模生產(chǎn) PGL的新方法。雖然恒細(xì)胞密度發(fā)酵有諸多的優(yōu)勢，但是最終的產(chǎn)物濃度較低，一定程度上制約了該模式的應(yīng)用。

汪志浩等[27]報道山梨醇作為輔助碳源，能夠有效提高堿性果膠酶在重組畢赤酵母中的表達(dá)能力。因此，應(yīng)用雙碳源流加以實現(xiàn)恒細(xì)胞密度發(fā)酵，可作為研究 PGL在畢赤酵母中高效表達(dá)的新策略。

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