GF級(jí)KM小鼠生長(zhǎng)曲線、主要臟器參數(shù)及生理生化指標(biāo)的測(cè)定分析

王俊風(fēng)，施美蓮，2，吳艷秋，郭建光，2，符 杰，2，孫宗國(guó)，高靜華，2，徐 平，2

（1.上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海 201615；2.中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 201615）

昆明小鼠具有抗病力強(qiáng)、繁殖率和成活率高等特點(diǎn)，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在我國(guó)生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中占有一定的用量［1］，特別廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究以及藥品、生物制品的生產(chǎn)與檢定［2］。19世紀(jì)末期，國(guó)際上逐步興起無(wú)菌動(dòng)物和SPF級(jí)動(dòng)物的研究，并相繼培育出了各種無(wú)菌級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)關(guān)于GF級(jí)KM小鼠生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化指標(biāo)的相關(guān)報(bào)道，GF級(jí)KM小鼠也沒(méi)有作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在科學(xué)研究中進(jìn)行規(guī)?；膽?yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用剖宮產(chǎn)術(shù)，用GF級(jí)C3H/OrlSlac小鼠做代乳母鼠（2009年從法國(guó)引進(jìn)），成功地培育出了GF級(jí)KM小鼠，并在無(wú)菌隔離器內(nèi)繁育擴(kuò)大后，對(duì)其后代進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育、臟器重量和血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定，為GF級(jí)KM小鼠的推廣和使用提供生物學(xué)特性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

SPF級(jí)KM小鼠、GF級(jí) C3H/OrlSlac小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供（SCXK【滬】2007-0005）（SYXK【滬】2007-0005）。

1.2 飼養(yǎng)管理及環(huán)境

實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在隔離器中，隔離器內(nèi)的空氣為100級(jí)全新風(fēng)，室內(nèi)溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度45％～65％，換氣次數(shù)每小時(shí)15次；光照明暗交替12 h/d；動(dòng)物自由采食和飲水。

小鼠用飼料和墊料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供（滬飼審【2008】04002），經(jīng)60Co輻照，劑量為 50 kGy。飼料的營(yíng)養(yǎng)成分為：粗蛋白21.5％ ～22.5％、粗脂肪 5.0％ ～5.5％、粗灰粉6.0％～6.5％、粗纖維4.0％～4.5％、水份≤10％、鈣1.2％ ～1.5％、磷 0.75％ ～1.0％、賴(lài)氨酸≥1.32％、蛋氨酸 +胱氨酸≥0.78％。飲用水為純水機(jī)制備的無(wú)菌酸化水，PH值3.5～4.5，并經(jīng)60Co輻照（輻照劑量為50 kGy）。使用的籠具、水瓶、鑷子等物品均經(jīng)過(guò)121℃、50 min高壓蒸汽滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平（精確到0.001 g，上海天平儀器廠）； 7020全自動(dòng)生化儀（日本日立公司）；KX-21N全自動(dòng)血球分析儀（日本 Sysmex）；5415R離心機(jī)（EPPendoff）；動(dòng)物固定臺(tái)；手術(shù)剪、眼科鑷子等常規(guī)手術(shù)器械。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物凈化方法：實(shí)驗(yàn)用GF級(jí)KM小鼠的獲得，是采用對(duì)SPF級(jí)KM小鼠進(jìn)行剖宮產(chǎn)術(shù)，用無(wú)菌奶媽?zhuān)o(wú)菌級(jí) C3H/OrlSlac小鼠2009年自法國(guó)引進(jìn)）代乳方法，2010年1月成功培育出第一批GF級(jí)KM小鼠，GF級(jí)KM小鼠在無(wú)菌隔離器內(nèi)進(jìn)行繁殖傳代并擴(kuò)群。

1.4.2 無(wú)菌檢測(cè)：根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物的生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法》GB/T 14926.41-2001，取GF級(jí) KM小鼠的飲水、飼料、墊料和新鮮糞便等混合物，接種到腦心浸液肉湯、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和大豆蛋白胨肉湯，分別于37℃、37℃和27℃下進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察并記錄（至14 d）。

1.4.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：用天平分別稱(chēng)取60只（雌雄各半）0～112 d的GF級(jí)KM小鼠體重。0～21 d每周稱(chēng)兩次，21～112 d每周稱(chēng)一次，用SPSS軟件繪制出GF級(jí)KM小鼠的生長(zhǎng)曲線。

1.4.4 體重和臟器重量的測(cè)定：用電子天平分別稱(chēng)取3個(gè)日齡無(wú)菌KM小鼠的體重。眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、腎上腺、卵巢、睪丸等臟器，用電子天平稱(chēng)取臟器重量。1.4.5 血液生理指標(biāo)測(cè)定：將小鼠眼眶采血，取20μL全血于500μL稀釋液中混勻，用Sysmex KX-21N全自動(dòng)血球分析儀檢測(cè)15項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)，分別為：白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞平均容量（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞分布寬度（PDW）、血小板分布寬度（MPV）、平均血小板體積（P-LCR）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV）、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）、淋巴細(xì)胞百分比（LYM％）、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值（LYM#）。1.4.6 血液生化指標(biāo)測(cè)定：將剩余的全血于4℃冰箱放置1 h后以3000 r/min離心15 min，分離出血清，用日立7020全自動(dòng)生化儀檢測(cè)指標(biāo)共19項(xiàng)，分別為：總膽固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、血糖（GLU）、尿素氨（BUN）、球蛋白（CRE）、CA、磷（P）、IgG、IgA、IgM、C3、C4。

1.5 結(jié)果處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行一維方差統(tǒng)計(jì)分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，顯著水平為P＜0.05和P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 GF級(jí)KM小鼠的微生物檢測(cè)結(jié)果

GF級(jí)KM小鼠本實(shí)驗(yàn)期間共檢測(cè)6次，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 GF級(jí)KM小鼠的生長(zhǎng)曲線

圖1為GF級(jí)KM小鼠的生長(zhǎng)曲線。雌、雄GF級(jí)KM小鼠的體重隨年齡的增加而增加，且在斷奶（21日齡）后的1～2周內(nèi)生長(zhǎng)最為迅速，之后體重增長(zhǎng)變緩，最后趨于穩(wěn)定；斷奶前雌雄小鼠體重基本無(wú)差異，斷奶后雄性小鼠增重明顯快于雌性小鼠，此結(jié)果與王俊風(fēng)、施美蓮等［3］報(bào)道的關(guān)于無(wú)菌級(jí)C3H/OrlSlac小鼠的生長(zhǎng)曲線的結(jié)果類(lèi)似。GF級(jí)KM小鼠的哺乳期的體重高于左謙益，寧磊［4］報(bào)道的KM小鼠同期的生長(zhǎng)發(fā)育數(shù)據(jù)。

2.3 GF級(jí)KM小鼠3個(gè)不同日齡的臟器參數(shù)

對(duì)同一日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠臟器參數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（表2），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：（1）28日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠在體重、肺、肝、右腎4項(xiàng)指標(biāo)的均值比較上差異顯著（P＜0.05）；（2）56日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠在體重、脾、腦、左腎、右腎5項(xiàng)指標(biāo)的均值比較上存在差異；（3）112日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠在體重、耳長(zhǎng)、心、肺、腦、腎上腺、胸腺、左腎、右腎9項(xiàng)指標(biāo)上存在差異。說(shuō)明性別對(duì)GF級(jí)KM小鼠臟器參數(shù)有影響，且隨著年齡的增加存在差異的指標(biāo)逐漸增加。

表1 GF級(jí)KM小鼠無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The results the examination of GF KM m ice

圖1 GF級(jí)KM小鼠的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curves of the GF KM mice

表2結(jié)果顯示，隨著年齡的增加心、腦、肝、脾、肺等主要臟器重量逐漸增加，只有胸腺隨著年齡的增加逐漸萎縮；在解剖時(shí)還發(fā)現(xiàn)GF級(jí)KM小鼠的盲腸體積特別大（見(jiàn)彩插2圖2），與王俊風(fēng)，施美蓮等［3］、程水生等［5］報(bào)道的無(wú)菌小鼠的特征之一是盲腸巨大結(jié)果一致。

2.4 GF級(jí)KM小鼠血液生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)同一日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠血常規(guī)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（表3），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：（1）28日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠在WBC、RBC、HGB、RDW-CV、HCT 5項(xiàng)指標(biāo)的均值比較上存在差異；（2）56日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠在PLT、LYM％、MCHC 3項(xiàng)指標(biāo)的均值比較上存在差異；（3）112日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠在WBC、PLT、LYM％、MCHC 4項(xiàng)指標(biāo)上存在差異。說(shuō)明性別對(duì)GF級(jí)KM小鼠血常規(guī)有影響。

從表3還發(fā)現(xiàn)隨著日齡的增加雌雄GF級(jí)KM小鼠HGB（血紅蛋白）逐漸增加、RDW±SD（紅細(xì)胞分布寬度）逐漸減小，血液中紅細(xì)胞分布寬度小說(shuō)明血液中紅細(xì)胞的形態(tài)、大小一致、整齊。

2.5 GF級(jí)KM小鼠血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)同一日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠血液生化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示：（1）28日齡的雌、雄GF級(jí)KM小鼠在TCHO、HDL-C、LDL-C、GLU 4項(xiàng)指標(biāo)的均值比較上差異極顯著（P＜0.01）；（2）56日齡的雌、雄 GF級(jí) KM小鼠在 TP、ALB、ALT、AST、ALP、BUN 6項(xiàng)指標(biāo)的均值比較上差異極顯著（P＜0.01）；（3）112日齡的雌、雄 GF級(jí)KM小鼠在 TCHO、TG、HDL-C、LDL-C、TP、ALB、BUN、C3 8項(xiàng)指標(biāo)上差異極顯著（P＜0.01）；在ALP、CRE、IgG、IgA、IgM 5項(xiàng)指標(biāo)上差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明性別對(duì) GF級(jí) KM小鼠血液生化的影響比較大，且隨著年齡的增加雌雄間差異更加明顯。

表2 GF級(jí)KM小鼠不同日齡的臟器參數(shù)測(cè)定Tab.2 Determination of the organ growth of GF KM mice at different agesBALB/cJmice

表3 GF級(jí)KM小鼠不同日齡血液生理指標(biāo)測(cè)定值Tab.3 Blood Physiological parameters of the GF KM mice at different ages

表4 GF級(jí)KM小鼠不同日齡血液生化指標(biāo)測(cè)定值Tab.4 Blood biochemical parameters of the GF KM mice at different ages

隨著日齡的增加，所測(cè)的19項(xiàng)血液生化指標(biāo)中反映腎功能的BUN（尿素氨）和ALB（白蛋白）先增加又減?。谎牵℅LU、CA）、P、免疫球蛋白和補(bǔ)體逐漸減小與王俊風(fēng)，施美蓮［3］報(bào)道的無(wú)菌級(jí) C3H/ OrlSlac小鼠的結(jié)果一致，這一結(jié)果與無(wú)菌動(dòng)物生活在無(wú)菌環(huán)境下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)處于休眠狀態(tài)，沒(méi)有接受任何菌群的刺激有關(guān)；CRE（球蛋白）先減小后又增加。

3 討論

在無(wú)菌動(dòng)物的培育和飼養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)菌狀態(tài)的維持是一個(gè)難點(diǎn)，從隔離器的消毒、無(wú)菌動(dòng)物的傳入到平時(shí)的物品傳入和傳出都必須進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作，另外定期進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)也是維持無(wú)菌狀態(tài)的關(guān)鍵；經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)所有GF級(jí)KM小鼠盲腸無(wú)一例外地明顯膨大，幾乎占據(jù)整個(gè)腹腔的25％ ～30％，在飼養(yǎng)的過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)大于八周齡的 GF級(jí)KM小鼠經(jīng)常出現(xiàn)突然死亡，這極有可能與其盲腸異常膨大且腸壁變薄有關(guān)。

無(wú)菌動(dòng)物生活在無(wú)菌的隔離器環(huán)境中，用現(xiàn)有的檢測(cè)方法無(wú)任何可檢測(cè)到的微生物的影響，其免疫系統(tǒng)未被激活，作為機(jī)體重要防御系統(tǒng)的白細(xì)胞群的水平比夏介英、雷培琪［6］報(bào)道SPF級(jí)KM小鼠的低很多，而且本實(shí)驗(yàn)中測(cè)出的GF級(jí)KM參與體液免疫的免疫球蛋白的水平普遍較低，這些特征決定了無(wú)菌動(dòng)物有很多SPF級(jí)動(dòng)物和清潔級(jí)動(dòng)物不可替代的應(yīng)用［7-9］。

目前國(guó)際上無(wú)菌動(dòng)物的應(yīng)用還很少，國(guó)內(nèi)沒(méi)有關(guān)于GF級(jí)KM小鼠的生物學(xué)特性數(shù)據(jù)的報(bào)道，而這些數(shù)據(jù)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和試驗(yàn)中重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，臟器重量及臟器系數(shù)是衡量動(dòng)物功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，血液生理生化正常值是生物醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)指標(biāo)，是臨床醫(yī)療和科學(xué)研究的重要依據(jù)，是評(píng)價(jià)封閉群動(dòng)物遺傳標(biāo)準(zhǔn)的一項(xiàng)重要指標(biāo)［10］。對(duì)GF級(jí)KM小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、臟器重量、血液學(xué)參數(shù)和生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，可為該無(wú)菌小鼠標(biāo)準(zhǔn)化鑒定和質(zhì)量控制提供依據(jù)，同時(shí)亦為無(wú)菌動(dòng)物在我國(guó)醫(yī)學(xué)科研中的廣泛應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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