胚胎腎分支形態(tài)發(fā)生調(diào)控因素

王偉玲，楊寶學(xué)

（北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

腎臟發(fā)育是一個(gè)極其精細(xì)的過(guò)程，發(fā)育的不同階段形成不同的器官（如前腎，中腎，后腎），后腎的發(fā)育起始于輸尿管芽的形成，當(dāng)輸尿管芽頂端侵入后腎間充質(zhì)，輸尿管芽和后腎間充質(zhì)相互誘導(dǎo)，按時(shí)空順序依次表達(dá)相應(yīng)基因，釋放轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子，促使后腎發(fā)育成熟。

GDNF及其受體

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族的一個(gè)亞家族中的一員，屬于半胱氨酸蛋白家族。GDNF亞家族受體由兩部分構(gòu)成，一部分為跨膜受體 RET，另一部分共同受體GFRα1-4（GDNF fam ily receptor）可與GDNF家族成員高度親和結(jié)合。受體與配體結(jié)合后激活以下通路：Ras/ERK、三磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3-kinase）、磷脂酶 C （phospholipase C gamma，PLCr）［1］，對(duì)輸尿管芽生長(zhǎng)和分支形態(tài)發(fā)生都有促進(jìn)作用。

Gdnf-/-，Ret-/-，或者Gfrα1-/-的小鼠不能形成正常的輸尿管芽，腎臟發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育［2］，證明了GDNF在誘導(dǎo)輸尿管芽出芽方面發(fā)揮重要作用。對(duì)Ret-/-和野生型細(xì)胞的嵌合體研究顯示野生型細(xì)胞集中在輸尿管芽頂部，而Ret-/-突變型細(xì)胞較少［3］，提示 GDNF/Ret信號(hào)還具有促 ND細(xì)胞遷移的能力。RET激活后誘導(dǎo)Wnt11在輸尿管芽頂端表達(dá)，而Wnt11進(jìn)一步誘導(dǎo)間充質(zhì)中GDNF的表達(dá)［4］。另一個(gè)被RET調(diào)節(jié)的基因是Sprouty1（Spry1），在輸尿管芽生長(zhǎng)和分支形成中起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。有趣的是 Gdnf-/-，Spry1-/-或Ret-/-，Spry1-/-的小鼠腎臟發(fā)育正常，而Gdnf-/-或Spry1-/-小鼠腎臟發(fā)育顯著異常，初步的研究證明正常情況下GDNF和FGF均受Spry1抑制，但GDNF誘導(dǎo)輸尿管芽出芽和延伸的作用占主要地位，當(dāng) GDNF和 Spry1敲除后FGF的抑制解除，得以發(fā)揮功能，從而能夠形成正常的 腎 臟。然 而Gdnf-/-，Spry1-/- 或Ret-/-，Spry1-/-的小鼠與野生型小鼠和Spry1單敲小鼠在分支形態(tài)發(fā)生存在顯著不同，揭示了GDNF在分支形態(tài)發(fā)生過(guò)程中的特異性作用［5］。還有一種抑制GDNF信號(hào)的分子是臂板蛋白（class 3 semaphorins，Sema3），抑制GDNF的表達(dá)和RET的磷酸化，敲除了Sema3a引起腎臟體積的短暫性增大，UB分支形成增多，在組織培養(yǎng)條件下過(guò)表達(dá)Sema3a后則產(chǎn)生相反的效果［6］。

Microarray技術(shù)檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)了其他 GDNF/Ret下游的蛋白，包括趨化因子受體 Cxcr4，趨化因子Crlf1，信號(hào)抑制因子 Dusp6和 Spred2，轉(zhuǎn)錄因子Myb，Etv4，Etv5［7］，這些蛋白的作用還有待于進(jìn)一步研究。最近對(duì)嵌合體的研究顯示野生型細(xì)胞分布于輸尿管芽頂端，而Etv4-/-，Etv-/-的細(xì)胞分布在輸尿管芽頂端之外的部位，與Ret-/-的細(xì)胞分布范圍類(lèi)似，Etv4-/-，Etv5-/-的細(xì)胞分布更加局限，提示Etv4，Etv5可能是多個(gè)通路的下游［8］。

故一旦出芽成功，GDNF經(jīng)正反饋環(huán)促進(jìn)新芽不斷生長(zhǎng)分支，分支到一定程度，GDNF又可經(jīng)負(fù)反饋環(huán)，減慢輸尿管芽分支，調(diào)節(jié)輸尿管芽數(shù)量和大小。

FGF及其受體

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）是由 150～200個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞間的信號(hào)分子，在各種器官胚胎的形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要的作用。FGF與其膜受體FGFR結(jié)合后，F(xiàn)GFR發(fā)生二聚體化，激活其下游的信號(hào)通路： PLCγ途徑；Ras/Raf/MEK/ERK途徑；JAK/STAT途徑；PI3-kinase，以上 4條路徑相互作用形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制。

FGF7和 FGF10表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞，以高親和力與FGFR2b結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)輸尿管芽生長(zhǎng)和腎單位形成的數(shù)量。FGFR2等位基因在輸尿管芽特異性敲除，腎臟體積顯著性減小，輸尿管芽分支少、腎單位少、輸尿管芽莖柄稀而細(xì)。缺乏 FGF7或 FGF10小鼠的腎臟明顯小于正常小鼠，離體的輸尿管芽培養(yǎng)系統(tǒng)顯示 FGF7引起的輸尿管芽以緊湊的方式分支，無(wú)明顯的莖柄和壺腹，F(xiàn)GF10則刺激形成長(zhǎng)莖柄和明顯的壺腹。FGF8 mRNA在胚胎12 d的腎臟開(kāi)始表達(dá)，條件敲除掉間充質(zhì)FGF8導(dǎo)致嚴(yán)重的腎發(fā)育不全［9］。這些結(jié)果表明FGF系列生長(zhǎng)因子對(duì)于輸尿管芽分支形成是重要的。

最近的研究顯示FGFR1能夠與Spred1的SPR結(jié)構(gòu)域和Sprouty/Spred家族中成員相連，起到抑制Ras/Raf/ERK的作用，同時(shí) Spred能夠延長(zhǎng) FGFR1在細(xì)胞膜上的保留時(shí)間，使其與配體充分作用［10］，提示FGF信號(hào)與GDNF存在重疊與相互作用。而Gdnf或 Ret單敲小鼠腎臟發(fā)育顯著異常，在Gdnf或Ret單敲的基礎(chǔ)上去除Spry后，腎臟能夠正常發(fā)育，但是這種逆轉(zhuǎn)作用在敲除Fgf10后消失了，也就是說(shuō)Gdnf-/-，Spry1-/-，F(xiàn)gf10-/-小鼠腎臟發(fā)育不全，F(xiàn)GF10發(fā)揮作用并不依賴GDNF，提示還存在其他信號(hào)通路調(diào)控［5］。

HGF及其受體

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （hepatocyte growth factor，HGF）屬于酪氨酸激酶受體超家族的一員，1991年，Bottaro［11］通過(guò)251I標(biāo)記的 HGF與細(xì)胞蛋白的共價(jià)交聯(lián)直接證明C-MET為HGF的受體。胚胎11 d腎間充質(zhì)細(xì)胞即有HGF和C-MET的表達(dá)，HGF與受體 Met特異結(jié)合后，可誘導(dǎo)Met上的酪氨酸磷酸化，激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路，包括 PLC、Ras、ERK1/2和 PI3-kinase等途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和遷移。

Vargas［12］發(fā)現(xiàn) HGF能夠刺激后腎間葉細(xì)胞向上皮分化，同時(shí)在輸尿管芽的管狀形態(tài)發(fā)生中起重要作用。Montesano等［13］證實(shí) HGF可誘導(dǎo)膠原凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中的犬腎細(xì)胞（madine darby canine kidney，MDCK）形成管狀結(jié)構(gòu)。研究表明，HGF經(jīng)MET介導(dǎo)的 PI3-kinase激活可誘導(dǎo)內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞（m IMCD-3）增殖、遷移和分支，對(duì)于趨化現(xiàn)象和集合管形成起重要作用。Akashi Togawa［14］的研究顯示HGF能夠上調(diào)Cdc42的表達(dá)量使細(xì)胞間緊密連接蛋白降解，促進(jìn)MDCK細(xì)胞遷移，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明HGF的這種作用是依賴Erk通路的。

BM P及其受體

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）家族中的一大亞類(lèi)，自從上世紀(jì)90年代最早報(bào)道了Bmp7基因缺失的小鼠腎發(fā)育不全［15］，關(guān)于 BMP在腎發(fā)育過(guò)程中作用成為研究熱點(diǎn)，揭示了BMP在中腎管的形成、輸尿管芽的形成、分支形態(tài)發(fā)生、腎單位祖細(xì)胞的存活和增殖等過(guò)程發(fā)揮重要作用。

BMP2在輸尿管芽周的間充質(zhì)組織中表達(dá)，腎組織培養(yǎng)和輸尿管芽離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示 BMP2可抑制輸尿管芽生長(zhǎng)分支。BMP4和BMP5參與集合管后階段腎盂和輸尿管的發(fā)育調(diào)控，BMP4主要在中腎和輸尿管周?chē)g充質(zhì)組織中表達(dá)，對(duì)抗后腎間充質(zhì)釋放的誘導(dǎo)信號(hào)GDNF，抑制Wnt11表達(dá)，從而抑制中腎管不適宜位點(diǎn)萌芽，減少中腎異位輸尿管分支的數(shù)目以及增加輸尿管形態(tài)的延長(zhǎng)，體外實(shí)驗(yàn)表明，外源BMP4同樣抑制輸尿管芽的形成，證實(shí)這一因子有能力直接影響輸尿管芽分支形態(tài)形成［16，17］。BMP7是胚胎腎發(fā)育的重要的誘導(dǎo)因子，表達(dá)于后腎間充質(zhì)及輸尿管芽及其衍生物 ，低濃度BMP7通過(guò)p38絲裂原活化蛋白激酶促進(jìn)輸尿管芽分支形成，高濃度則抑制分支形成［18］。在體內(nèi)，BMP7主要起到抑制間充質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生的作用，從而協(xié)調(diào)輸尿管芽分支和小管上皮的形成［19］。GREMLIN1（GREM1）是內(nèi)源的 BMP4拮抗劑，Alexandre Goncalves的研究顯示 GREM1還能拮抗BMP7，Grem1敲除小鼠腎發(fā)育不全，但給予外源BMP4或BMP7抑制劑后則能形成正常的腎臟［20］。

細(xì)胞外基質(zhì)

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）是胚胎發(fā)育過(guò)程中主要有間充質(zhì)細(xì)胞合成并分泌的大分子物質(zhì)，包括纖維性成分 （膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白）、連接蛋白（纖維粘連蛋白、層粘連蛋白）和空間充填分子 （主要為糖胺聚糖），對(duì)細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。

體外實(shí)驗(yàn)顯示，在純基質(zhì)膠中培養(yǎng)，IMCD細(xì)胞可形成多細(xì)胞包囊，在Ⅰ型膠原中培養(yǎng)，IMCD細(xì)胞則形成實(shí)心分支索，在膠原和基質(zhì)膠混合凝膠中培養(yǎng)，IMCD細(xì)胞形成中空分支管狀結(jié)構(gòu)，由此可見(jiàn)，細(xì)胞與基質(zhì)相互作用在上皮組織結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中起重要作用［21］。研究這些基質(zhì)成份發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白能促進(jìn)成年小鼠的 IMCD形成分支管狀結(jié)構(gòu)，Ⅳ型膠原和玻連蛋白則起到抑制作用［9］。最近的研究顯示纖連蛋白能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生Btbd7蛋白，Btbd7蛋白進(jìn)而上調(diào)Snail2，抑制E-鈣黏蛋白表達(dá)，促進(jìn)芽體裂隙的形成，體外實(shí)驗(yàn)證明Btbd7具有促進(jìn)MDCK細(xì)胞遷移的功能［22］。

由于輸尿管芽形成過(guò)程涉及細(xì)胞增殖、遷移、擴(kuò)展，當(dāng)細(xì)胞絲狀偽足向外延伸時(shí)，需要降解周?chē)幕|(zhì)，作為降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要降解酶—基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在分支形態(tài)發(fā)生過(guò)程同樣發(fā)揮重要作用。Catherine Arnould［23］的研究顯示 Mmp9-/-小鼠腎臟發(fā)育延遲，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)顯示MMP9缺失后Caspase3表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡增加，表明在腎臟發(fā)育階段 MMP9抑制間充質(zhì)細(xì)胞凋亡。Mmp14-/-的小鼠腎臟發(fā)育過(guò)程中不能進(jìn)行正常的分支形態(tài)發(fā)生。此外，MMP14能夠使ECM重構(gòu)從而誘導(dǎo)分支形態(tài)發(fā)生，促進(jìn)BMP的表達(dá)或自分泌形式促進(jìn)細(xì)胞遷移［24］。

整合素

作為許多 ECM的受體，整合素（integrin）在胚腎發(fā)育過(guò)程中的作用不可忽視。整合素屬于細(xì)胞表面受體，α，β亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，其細(xì)胞外區(qū)與特異的細(xì)胞外基質(zhì)成份（如：Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白）結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞粘附，其胞內(nèi)區(qū)可將生物信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞的分裂、增殖。

整合素能夠誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞和腎形成分支［25］。用抗體阻斷整合素的功能后，髓質(zhì)集合管的形成受阻，證實(shí)整合素在髓質(zhì)集合管形成過(guò)程中是不可缺的重要中介物［21］。

當(dāng)在輸尿管芽特異性敲除整合素 α3亞基，腎乳頭不能形成或形成異常［26］。整合素α8在間充質(zhì)細(xì)胞呈極性分布，α8缺失小鼠的輸尿管芽不能形成分支，同時(shí)間充質(zhì)細(xì)胞也不能轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞。β1在胚胎10.5 dUB頂端表達(dá)，Hox b7/Cre小鼠特異性敲除整合素 β1后腎臟分支形成異常，在出生后發(fā)生進(jìn)行性腎損傷，并出現(xiàn)水通道蛋白AQP2表達(dá)的減少［25］。研究發(fā)現(xiàn)，由 FGF介導(dǎo)的經(jīng)典的信號(hào)途徑也需要整合素 β1的參與。在 β1整合素敲除而FGFR維持正?；钚缘那闆r下，F(xiàn)GF信號(hào)依舊有所減弱［25］，因此，整合素β1除了在粘附和細(xì)胞遷移方面發(fā)揮其經(jīng)典作用之外，在輸尿管芽分支形態(tài)發(fā)生中也起到介導(dǎo)某些生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)的作用。

粘附相關(guān)蛋白

介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的分子，鈣黏蛋白和整合素發(fā)揮著主要作用，與細(xì)胞分裂、遷移、分化和凋亡緊密相關(guān)，在維持實(shí)體組織形成以及在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞選擇性相互聚集、重排有重要作用［27］。

鈣黏蛋白是一類(lèi)鈣離子依賴的粘附分子家族，在腎臟發(fā)揮過(guò)程中有許多鈣黏蛋白的表達(dá)，輸尿管芽上主要表達(dá)E-鈣黏蛋白，而在間充質(zhì)鈣黏蛋白種類(lèi)存在一定的轉(zhuǎn)換［28］，鈣黏蛋白的胞漿部分與catenin相互作用，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，敲除E-鈣黏蛋白的MDCK細(xì)胞3D培養(yǎng)條件下形成大量囊泡而非小管樣結(jié)構(gòu)［28］。Clara Martinea-Rico等［29］將磁珠用纖連蛋白和多聚賴氨酸分別包備，與 S180細(xì)胞或過(guò)表達(dá) E-鈣黏蛋白的細(xì)胞共孵育，而后使用雙針檢測(cè)技術(shù)（dual pipette assay）檢測(cè)將磁珠和細(xì)胞分離開(kāi)的作用力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)E-鈣黏蛋白的細(xì)胞與纖連蛋白包備的磁珠作用力最大，也就是說(shuō)E-鈣黏蛋白與纖連蛋白產(chǎn)生的粘附作用最強(qiáng)，提示鈣黏蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞—基質(zhì)間相互作用發(fā)揮一定作用。

還有一些蛋白雖然不屬于粘附因子，但起到細(xì)胞黏附的作用，比如 Kif26b，屬于驅(qū)動(dòng)蛋白家族，作為Sall1的下游調(diào)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞間的粘附，在胚胎10.5 d于后腎間充質(zhì)表達(dá)。Kif26b-/-的間充質(zhì)細(xì)胞與輸尿管芽細(xì)胞間的緊密連接減弱，整合素α8分布的極性也減弱，導(dǎo)致間充質(zhì)的GDNF減少，過(guò)表達(dá)Kif26b使細(xì)胞間粘附增強(qiáng)［30］。

結(jié)語(yǔ)

胚胎腎的發(fā)育受多種因素的制約和調(diào)節(jié)（圖1），盡管已經(jīng)知道上述因素能影響胚胎腎的發(fā)育，但還有很多機(jī)制尚不清楚。大量研究顯示成熟腎臟在病理狀態(tài)下高表達(dá)的分子，在腎臟發(fā)育過(guò)程中也高表達(dá)，而且細(xì)胞表型的改變類(lèi)似于胚胎腎發(fā)育過(guò)程中后腎間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的逆過(guò)程，提示腎臟損傷后細(xì)胞的再生過(guò)程和腎臟胚胎發(fā)育過(guò)程有著極其密切的關(guān)系，對(duì)腎發(fā)育的研究也有助于理解后天性腎臟疾病發(fā)生的病理生理機(jī)制。

圖1 胚胎腎分支形態(tài)發(fā)生調(diào)控因素Fig.1 Regulation of branchingmorphogenesis in kidney development

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