四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎致SD大鼠肝纖維化病理學(xué)比較

孫 俠，黃小瓊，鐘海潮，饒子亮，鐘志勇，王 剛

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248）

肝纖維化（hepatic fibrosis）是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（特別是膠原）過度沉積。它不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是許多慢性肝病的共同病理過程。幾乎各種慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化，其病因大致可分為感染性（慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎，血吸蟲病等），先天性代謝缺陷（肝豆?fàn)詈俗冃浴⒀?、?-抗胰蛋白酶缺乏癥等）及化學(xué)毒物性（慢性酒精性肝病、慢性藥物性肝病）及自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎等。本實(shí)驗(yàn)采用3種［1-3］不同方法分別建立四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎致SD大鼠肝纖維化模型，并對(duì)3種肝纖維化模型大鼠肝臟病理學(xué)改變進(jìn)行比較，初步探討肝纖維化病變發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，34只，雄性，4周齡，體重180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證粵監(jiān)證字號(hào)：SCXK（粵）2008-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0056726。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SD大鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)： 0028828，室內(nèi)溫度20～25℃，相對(duì)濕度40～70％，換氣量10～12次/h，照明12 h明暗交替；用標(biāo)準(zhǔn)大鼠箱飼養(yǎng)，每箱5只，水料充足，SPF級(jí)飼料產(chǎn)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要試劑

四氯化碳：廣州市中南化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：060213；橄欖油：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20040614；戊巴比妥鈉：北京化學(xué)試劑公司，規(guī)格：25 g，批號(hào)：061222；酒精：北京紅星股份有限公司，規(guī)格：2 L，純度：60％；吡唑：上海晶純?cè)噭┯邢薰?，?guī)格：25 g，純度：98％，批號(hào)：11169；玉米油：益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司，規(guī)格：900 m L。病理檢測(cè)試劑：乙醇、二甲苯、甲醛、蘇木素、伊紅等。

1.1.4 主要儀器

YP3001N電子d平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；PB203-N電子分析d平：梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)，湖北宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司，型號(hào)：TS-12N；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國(guó)徠卡，型號(hào)：RM2135；全自動(dòng)生物組織染色機(jī)，湖北宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司，型號(hào)：RS-18Ⅱ；熒光病理圖像分析系統(tǒng)，型號(hào)：OLYMPUS BX41。

1.2 方法

1.2.1 造模［1-3］

SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組8只，四氯化碳組8只，酒精與四氯化碳聯(lián)合組9只，膽管結(jié)扎組9只。四氯化碳組以3 mg/kg的劑量（首次劑量加倍）皮下注射50％四氯化碳（四氯化碳∶橄欖油=1∶1），每周2次，連續(xù)注射6周；酒精與四氯化碳聯(lián)合組每日按照10 m L/kg劑量灌服酒精混合物（酒精∶吡唑∶玉米油=10 mL∶25 mg∶2 mL），同時(shí)每周2次按0.3 mL/kg劑量給予腹腔注射四氯化碳：橄欖油（1∶3），連續(xù)造模60 d；膽管結(jié)扎組大鼠按10 mg/kg體重腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，腹部皮膚消毒，無(wú)菌操作沿腹部正中線剪開腹腔，分離出膽管，在膽管近端和遠(yuǎn)端2處結(jié)扎膽管，28 d后結(jié)束造模。

1.2.2 病理學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠用乙醚麻醉后處死，解剖觀察肝臟病變，并采取肝臟組織用10％福爾馬林固定48 h，按常規(guī)程序制作石蠟切片，切片厚度4μm， HE染色，masson三色染色顯微鏡下觀察并拍照。觀察肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)是否紊亂，小葉內(nèi)肝細(xì)胞是否變性、壞死，匯管區(qū)有無(wú)纖維組織增生、小膽管增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。

1.2.3 肝纖維化病變半定量、定量分析

肝纖維化分期半定量評(píng)估采用Scheuer評(píng)分系統(tǒng)［4-5］：0分：無(wú)纖維化；1分：匯管區(qū)擴(kuò)大；2分：匯管區(qū)纖維化，少量間隔形成；3分：纖維間隔形成明顯伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂；4分：可能或肯定的肝硬化。肝纖維化病變定量分析：每份標(biāo)本在低倍視野（10× 10）下依次選取左上、右上、左下、右下、中間5個(gè)視野（共1.5 mm2），采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定視野內(nèi)肝纖維化病變總面積。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用One-Way ANOVA比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟外觀比較

正常對(duì)照組大鼠肝臟表面暗紅，邊沿銳利，質(zhì)地軟；四氯化碳組大鼠肝臟呈灰黃色，飽滿粗糙，表面有大小不等的結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，韌性大；膽管結(jié)扎組大鼠肝臟腫大，呈黃綠色，質(zhì)地中等硬，膽總管自結(jié)扎處以上明顯擴(kuò)張；酒精與四氯化碳聯(lián)合組大鼠肝臟較正常肝臟暗淡，質(zhì)地偏硬，部分表面凹凸不平。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)改變

正常對(duì)照組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，小葉內(nèi)肝細(xì)胞索排列較整齊，肝細(xì)胞大小均勻，無(wú)變性、壞死，匯管區(qū)未見纖維組織增生和小膽管增生。四氯化碳組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不清甚至被破壞，肝細(xì)胞彌漫脂肪變性，匯管區(qū)及中央靜脈周圍見少量至中量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生較明顯。酒精與四氯化碳聯(lián)合組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不清甚至被破壞，局灶至彌漫肝細(xì)胞水腫伴脂肪變性，匯管區(qū)及中央靜脈周圍見少量至中量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生明顯。膽管結(jié)扎組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不清甚至被破壞，肝細(xì)胞未見變性，小葉內(nèi)及匯管區(qū)見少量至中量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，小膽管伴纖維組織增生明顯。參見彩插4圖1。

2.3 各組大鼠肝纖維化病變半定量、定量比較

四氯化碳組、酒精與四氯化碳聯(lián)合組、膽管結(jié)扎組大鼠肝纖維化程度與正常對(duì)照組比較顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果提示四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎致SD大鼠肝纖維化模型造模基本成功。膽管結(jié)扎組大鼠肝纖維化程度較四氯化碳組、酒精與四氯化碳聯(lián)合組加重。參見表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別采用多次皮下注射50％四氯化碳、膽管近端和遠(yuǎn)端2處結(jié)扎膽管、酒精混合液灌胃結(jié)合微量四氯化碳腹腔注射復(fù)合因素等方法成功建立肝纖維化大鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎均可誘發(fā)SD大鼠肝纖維化的形成，四氯化碳組大鼠可見肝細(xì)胞的彌漫性脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，酒精與四氯化碳聯(lián)合組大鼠可見肝細(xì)胞的酒精性水腫伴脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，膽管結(jié)扎組大鼠可見小膽管的明顯增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。其中，膽管結(jié)扎模型屬于膽汁性肝硬化，適合于模擬臨床膽汁性肝硬化（由膽管堵塞、膽道先d畸形、寄生蟲等因素引起膽汁淤積所致肝硬化），其病變以間質(zhì)、膽管增生為主，早期肝細(xì)胞正常，晚期才出現(xiàn)肝細(xì)胞的變性、壞死。四氯化碳模型屬于化學(xué)毒物性肝硬化，適合于模擬臨床化學(xué)藥物性肝硬化（由長(zhǎng)期、慢性化學(xué)藥物中毒引起），其病變以肝細(xì)胞變性、壞死以及肝小葉改建為假小葉為主。酒精與四氯化碳聯(lián)合模型屬于酒精性肝硬化，適合于模擬臨床酒精性肝硬化（由長(zhǎng)期、慢性酒精中毒引起），其病變與其它化學(xué)藥物以及各種病毒性肝炎引起肝硬化的病變相類似，均以肝細(xì)胞變性、壞死以及肝小葉改建為假小葉為主。

表1 各組SD大鼠肝臟組織纖維化半定量、定量比較Tab.1 Sem i-quantitative，quantitative comparison of SD rats liver fibrosis in each group

肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，多項(xiàng)研究表明，很多不同的因素（病毒性肝炎、慢性酒精中毒、營(yíng)養(yǎng)不良、有毒物質(zhì)的損傷作用等）均可引起肝細(xì)胞的損害，如長(zhǎng)期作用，反復(fù)發(fā)作，可導(dǎo)致肝內(nèi)廣泛的膠原纖維增生，增多的膠原纖維來源有兩種：其一為肝細(xì)胞壞死后，肝小葉內(nèi)原有的網(wǎng)狀支架塌陷、聚積、膠原化或由肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維；其二為匯管區(qū)的成纖維細(xì)胞增生并分泌產(chǎn)生，廣泛增生的膠原纖維向肝小葉內(nèi)延伸，分割肝小葉，嚴(yán)重時(shí)肝小葉內(nèi)的膠原纖維連接成纖維間隔包繞原有的或再生的肝細(xì)胞團(tuán)，形成假小葉，這些病變隨著肝細(xì)胞不斷壞死與再生而反復(fù)進(jìn)行，最終形成彌漫全肝的假小葉，并導(dǎo)致肝內(nèi)血液循環(huán)改建和肝功能障礙而形成肝硬化［6］。四氯化碳、酒精、膽管結(jié)扎這三種因素可引起肝細(xì)胞變性、小膽管增生、肝炎等肝臟損傷，后經(jīng)反復(fù)作用，從而進(jìn)一步導(dǎo)致肝內(nèi)廣泛的膠原纖維增生。

目前，針對(duì)肝纖維化的治療方法［7］大致分為：①去除病因治療；②抑制肝臟炎癥；③抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）激活和增殖，促進(jìn)HSC凋亡；④抑制細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成，促進(jìn) ECM降解；⑤基因治療。其中，去除病因治療是治療肝纖維化最直接、有效的方法。在進(jìn)行病理、藥理、毒理等方面研究時(shí)可根據(jù)實(shí)際需要選擇與病因相一致的肝纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行研究。

［1］范明霞，周康榮，沈繼章，等.大鼠CC14誘發(fā)的肝纖維化模型Mn-DPDPMR研究［J］.臨床放射學(xué)雜志，2004，23（8）：722 -726.

［2］王兵，朱平生.茵陳四苓散防治膽管結(jié)扎大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.河南中醫(yī)，2005，25（7）：20-22.

［3］王磊，季光，鄭培永，等.大鼠酒精性肝纖維化復(fù)合模型的建立［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2006，4（3）：281-284.

［4］Scheuer PJ，Lefkowitch JH.Liver biopsy interpretation，6 th ed.London：Saunders，2000：274.

［5］Bedossa P，Paradis V.Liver extracellular matrix in health and disease［J］.JPathol，2003，200：504-515.

［6］李玉林主編.第七版病理學(xué).人民衛(wèi)生出版社.2008，181 -182.

［7］陳瀟瀟，陸倫根.肝纖維化的臨床研究進(jìn)展［J］.中國(guó)肝病學(xué)，2008，13（4）：338-340.