豬偽狂犬病毒gB基因在大腸桿菌中的分段表達

包新奇，黃紹華，劉巧榮，孫 明，楊 璐，申屠芬琴，康立平，陳西釗，4

（1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210036；2.徐州市高校獸醫(yī)站，徐州 221006；3.北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100085；4.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

偽狂犬 （Pseudorabies）又稱奧捷士奇?。ˋujeszky＇s，AD），是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的包括多種病畜和野生動物共患的一種急性傳染?。?］。豬是該病的自然宿主和貯存者。可引起妊娠母豬的流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎，新生仔豬的大量死亡。自1902年發(fā)現(xiàn)以來，偽狂犬病已在全球范圍內(nèi)流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，成為嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。該病毒屬于皰疹病毒科A皰疹病毒亞科，為雙股線形DNA，約150 kb，編碼70～100種蛋白。目前已經(jīng)鑒定了 11種糖蛋白，其中 gB（glycoprotein B）是最主要的保護性抗原之一，能刺激機體產(chǎn)生補體依賴性和補體非依賴性的中和抗體以及病毒特異性的細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)［1］。

gB基因在皰疹病毒成員中屬于最保守的糖蛋白基因，在不同的皰疹病毒之間，gB蛋白的功能可以相互取代［2］。其大小約2.8 kb，編碼913個氨基酸。擁有一段信號肽系列（N端的58個氨基酸）。成熟的gB蛋白C端有3個疏水區(qū)，其中最后一個疏水區(qū)為跨膜區(qū)（740～808 aa）。gB以二硫化物連接的三聚糖蛋白復(fù)合體的形式存在，即gBa，gBb和gBc，大小分別為855 aa（59～913 aa）、444 aa（59～502 aa）和411 aa（503～913 aa）。gBb和gBc是gBa剪切后的產(chǎn)物［4，5］。gB蛋白有多個抗原決定簇，其中59～126之間有3個連續(xù)的抗原決定簇，在214～279 aa之間有一個連續(xù)的抗原決定簇，在540～734 aa區(qū)間有8個潛在的非連續(xù)抗原決定簇，其中有兩個位點位于540～646 aa之間［3］。根據(jù) gB的以上特點，本研究將PRV的gB基因分4個片段進行表達和鑒定，為研制豬偽狂犬病gB抗體檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株與血清

偽狂犬病毒毒株為新疆分離株，由中國動物疫病預(yù)防控制中心提供。感染偽狂犬病毒的陽性血清、陰性血清、22份豬血清臨床樣品均為本試驗室保存。

1.2 載體、菌株、試劑

pGEM-T-easy、內(nèi)切酶 EcoR I和 Sal I購自Promega公司。pGEX-6P-1表達載體購自Amersham Pharmacia公司。大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。氨芐青霉素、辣根過氧化酶標記的抗豬IgG購自Sigma公司。病毒DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自 Omega公司。gB-ELISA試劑盒購自IDEXX公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

依據(jù)發(fā)表的gB序列（序列號：A68929），分別在氨基酸位置59～502 aa，39～155 aa、368～575 aa和540～740 aa設(shè)計4對引物，上、下游引物分別加EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點。

gB-1：PRV-Bb-F：5＇-ATAGAATTCATGGCGGCCGTG ACGCGG-3＇

PRV-Bb-R：5＇-ATTGTCGACTTAGCGCCGGGCCC GACGGGC-3＇

gB-3：PRV-59-F：5＇-ATAGAATTCATGGCGGCCGTGA CGCGG-3＇

PRV-59-R：5＇-TTTGTCGACTTAGAAGGAGTCGT AGGGGTAC-3＇

gB-4：PRV-368-F：5＇-ATAGAATTCATGCCCAAGAC GCGGCGCGT-3＇

PRV-368-R：5＇-TTTGTCGACTTAGCTGGGGTTC AGGCGCGACA-3＇

gB-5：PRV-540-F：5＇-ATAGAATTCATGATCCAGG CGCACGTGAAC-3＇

PRV-540-R：5＇-TTTGTCGACTTAGTAGAACTTG AGCGCGTGCA-3＇

4對引物分別可擴增大小為1332 bp、714 bp、624 bp和603 bp的片段。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 擴增及克隆

1.4.1 病毒DNA的提?。簠⒄誒mega公司的病毒DNA提取試劑盒操作說明提取PRV總DNA。

1.4.2 PCR擴增：程序為95℃ 3 min，94℃ 45 s，72～52℃ 60 s，72℃ 90s，40個循環(huán)后，72℃ 延伸10 min。

1.4.3 PCR產(chǎn)物電泳、克隆和序列測定：PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Omega公司膠回收試劑盒回收 PCR產(chǎn)物，克隆到 pGEM-T-easy，經(jīng)PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將陽性質(zhì)粒用EcoR I和Sal I進行雙酶切，回收gB各片段，連接至經(jīng)同樣雙酶切的原核表達載體pGEX-6P-1中，構(gòu)建原核重組表達質(zhì)粒pGEX-6pgB-1、pGEX-6p-gB-3、pGEX-6p-gB-4和pGEX-6p-gB-5。轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Sal I酶切鑒定，鑒定正確的陽性質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 誘導(dǎo)表達、純化及鑒定

陽性單菌接種于LB/AMP培養(yǎng)液中，當菌搖至OD600=0.6～0.8時，加入終濃度為 1 mM/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，收菌。菌體超聲破碎，4℃ 10000 r離心10 min，收集上清和沉淀。用電洗脫的方法進行重組蛋白純化，按照文獻［6］的方法進行SDS-PAGE和Western blotting鑒定，同時進行薄層掃描分析目的蛋白的表達情況。

1.7 ELISA

間接ELISA：以3種gB抗原為包被抗原建立間接ELISA方法：用方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度、最佳血清稀釋度、包被時間、二抗?jié)舛纫约胺磻?yīng)時間等。將建立的 ELISA分別命名為gB3-ELISA、gB4-ELISA和gB5-ELISA。.

臨床樣品檢測：以IDEXX公司gB-ELISA為對照，用gB3-ELISA、gB4-ELISA和gB5-ELISA檢測22份豬血清臨床樣品，評價3種抗原用于檢測豬偽狂犬gB抗體情況。

2 結(jié)果

2.1 克隆、鑒定及測序

gB基因各片段擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳顯示，分別可見約1330 bp、700 bp、620 bp和600 bp的4個基因片段（見圖1），大小與gB基因相符，預(yù)測證實所克隆的基因完全正確。

圖1 gB片段擴增Fig.1 PCR products of gB

2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定

4種重組表達質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，分別可見約1330 bp、700 bp、620 bp和600 bp的目的基因片段。見圖2。測序結(jié)果于預(yù)期相符。

圖2 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Digestion of recombinant p lasmids for prokaryotic expression with EcoR I和Sal I

2.3 重組蛋白的表達與純化

IPTG誘導(dǎo)4h的破菌沉淀和上清經(jīng)SDS-PAGE分析，分別在75、51.9、49和48.7×103Da處出現(xiàn)目的條帶（圖3）。與gB-1、gB-3、gB-4和gB-5的理論分子量相符。4種融合蛋白主要以包涵體形式存在。薄層掃描分析顯示：gB-3、gB-4和gB-5的表達量較高，約占菌體總蛋白30％、35％和39％。gB-1的表達量較低僅占菌體總蛋白的10％（圖略）。

圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.4 Westernblotting鑒定

用PRV陽性血清作一抗，抗豬IgG的抗體為二抗。分別對菌體蛋白和純化蛋白進行 Western blotting鑒定。結(jié)果表明，4種蛋白均可與陽性血反應(yīng)（圖4），由于 gB-1表達量不高，難以純化。對表達的gB-3、gB-4和 gB-5進行了純化和鑒定。其中圖4-A為未純化的蛋白與陽性血清鑒定結(jié)果，圖4-B為純化蛋白鑒定結(jié)果。圖4-A顯示4種重組蛋白均可與陽性血清反應(yīng)，gB-1由于蛋白量低，陽性帶隱約可見，其他條帶比較清楚。

圖4 gB1、gB2、gB3和gB5重組蛋白的Western blottingFig.4 Western blotting of recombinant proteins of gB1、gB2、gB3 and gB5

2.5 ELISA檢測

用初步建立的間接ELISA方法與IDEXX公司的gB-ELISA試劑盒同時檢測22份臨床豬血清樣品。結(jié)果顯示，以gB-3，gB-4，gB-5為抗原建立的間接IELISA方法和IDEXX公司的gB-ELISA方法的符合率分別為 40.9％（9/22）、81.8％（18/22）和81.8％（18/22）。具體見表1。

3 討論

本研究依據(jù)gB蛋白有多個B細胞抗原決定簇的特點，設(shè)計4對特異性引物，擴增含不同抗原決定簇的基因片段進行分段表達。尋找抗原性好的蛋白，用來制作gB抗體檢測試劑盒。結(jié)果顯示，表達的4種重組蛋白均能與PRV陽性血清反應(yīng)。其中g(shù)B-1表達量較低，gB-3，gB-4和gB-5表達量較高。

國外學(xué)者對gB的生物學(xué)功能進行了大量研究。Favoreel等［7］發(fā)現(xiàn)gB和gD共同誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體能引起酪氨酸磷酸化依賴信號轉(zhuǎn)換途徑的激活，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)吞作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，gB還能調(diào)節(jié)PRV的傳播，在神經(jīng)元-細胞連接點病毒單獨釋放時，由 gB/gH/gL組成的融合復(fù)合體通過附近并列的薄膜進入軸突連接的細胞［8］。以gB構(gòu)建的DNA疫苗可以誘導(dǎo)豬體的細胞免疫，并且在早期感染時能夠減少病毒的排泄［9］。用桿狀病毒表達gB蛋白免疫鼠收集的抗體可以在體外中和PRV，并且免疫鼠能抵抗 PRV致死性攻擊［10］。用桿狀病毒系統(tǒng)表達的 gB蛋白建立夾心 ELISA方法，能檢測感染PRV7 d的豬血清中的gB抗體，也可檢測未感染小豬血清中的母源抗體。

我國主要免疫PRV gE缺失疫苗預(yù)防豬偽狂犬病，以檢測gE抗體來區(qū)分PRV免疫和自然感染豬。目前已有商品化的gE和gB抗體ELISA試劑盒出售，在豬偽狂犬病防控中發(fā)揮了重要作用。鄒浩勇等研究發(fā)現(xiàn)gB抗體與中和抗體具有很好的相關(guān)性［11］。gB-ELISA試劑盒檢測PRV中和抗體陽性血清，可檢測97.8％的陽性率；而gE-ELISA試劑盒只能檢出34.6％的陽性率［11］。因此，檢測豬血清中的gB抗體可用于疫苗免疫效果評估。

本研究表明，用大腸桿菌表達的不同片段的gB抗原均能與豬偽狂犬陽性血清反應(yīng)。以gB-4和gB-5重組抗原建立的ELISA方法與IDEXX公司的gBELISA試劑盒符合率均為81.8％。但是限于檢測樣品的數(shù)量較少，抗原評價可能存在差異。仍需擴大檢測樣品數(shù)量，進一步評估鑒定。

4 小結(jié)

首次成功對 gB基因進行了分段表達，表達的重組蛋白均能被PRV陽性血清識別。其中g(shù)B-4和 gB-5具有較好的抗原活性，適用于豬偽狂犬 gB抗體檢測試劑盒的進一步研究。

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