奧曲肽聯(lián)合多西他賽對胃癌細胞抑制作用的研究

申 申

遼寧醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，遼寧錦州 121000

臨床和基礎研究均表明生長抑素類似物奧曲肽（OTC）不僅能抑制多種內(nèi)分泌激素分泌，而且對多種腫瘤生長也具有抑制作用，可作為聯(lián)合用藥方案的基礎。 多西他賽(DOC)為紫杉醇類抗腫瘤藥物，單藥或聯(lián)合其它化療藥在進展期胃癌的治療中已顯示了較明顯的優(yōu)勢。 現(xiàn)應用奧曲肽聯(lián)合多西他賽干預胃癌細胞生長，驗證奧曲肽對多西他賽是否有增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗試劑

SGC-7901，多西他賽(20 mg，0.5 mL )，生長抑素類似物奧曲肽，胎牛血清，RPMI.1640 干粉培養(yǎng)基，胰酶，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，碘化丙啶（PI），33258 熒光染料。

1.2 試驗方法

1.2.1 奧曲肽、 多西他賽及聯(lián)合用藥對胃癌細胞增殖的影響 該實驗設計奧曲肽藥物分組濃度為1、5、20 ng/ mL; 多西他賽濃度為1、5、10、20、40 ug/mL。 取對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901 細胞，胰酶消化，制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×104/ mL，每孔種200 uL 細胞懸液于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，同時設立細胞對照組、奧曲肽處理組（1、5、20ng/mL）、多西他賽處理組（1、5、10、20、40 μg/mL）、聯(lián)合用藥組（奧曲肽+多西他賽1ng/mL+1μg/mL、1 g/mL+5 μg/mL、1 ng/mL+10 μg/mL、1 ng/mL+20 μg/mL、1ng/mL+40 μg/mL、5 ng/mL+1μg/mL、5 ng/mL+5 μg/mL、5 ng/mL+10 μg/mL、5 ng/mL+20 μg/mL、5 ng/mL+40 μg/mL 、20 ng/mL+1 μg/mL、20 ng/mL+5 μg/mL、20 ng/mL+10 ng/mL、20 ng/mL+20 μg/mL、20 ng/mL+40 μg/mL）每組設8 個復孔。置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。于48 h 后取出96 孔板，2000 rpm 離心10 min， 超凈工作臺無菌條件下棄去上清，加200 uL/孔RPMI.1640 培養(yǎng)液及20 ul/孔MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 取出后2000 rpm 離心10 min， 棄去上清液， 加150 uL/孔DMSO 震蕩10 min 混勻，待溶解完全后酶標儀比色，波長570 nm。計算各組濃度抑制率。

1.2.2 流式細胞術(shù)分析細胞周期 根據(jù)MTT 比色法分析實驗結(jié)果取抑制率最高濃度組，設立不加藥對照組、奧曲肽20 ng/mL組、多西他賽40 μg/mL 組、聯(lián)合用藥奧曲肽20 ng/mL+多西他賽40 μg/mL 組，以胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的SGC-7901 細胞，將細胞收集到含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，調(diào)整細胞數(shù)為105/mL，取2 mL 細胞種于6 孔板孔內(nèi)培養(yǎng)24 h，后分別以預設藥物處理細胞24 h，1500 rpm 離心5 min 棄上清，再用PBS 洗兩次， 離心棄上清，PBS 懸浮細胞， 緩慢滴加70%冷乙醇邊滴加邊旋攪防止細胞結(jié)塊成團，于－20℃固定至少24 h，而后離心棄乙醇，用PBS 洗去乙醇，離心棄上清，1 mL PI 熒光染料孵育30 min，采用流式細胞儀，進行檢測。 重復3 次。

1.2.3 Hoechest33258 熒光染色檢測 取普通潔凈蓋玻片于濃硫酸-重鉻酸鉀清潔液中浸泡過夜，自來水洗滌5 遍，蒸餾水沖洗10 遍，于70%乙醇中浸泡24 h，紫外燈照過夜，無菌超凈臺內(nèi)吹干。 取對數(shù)生長細胞，105/mL 密度接種于放有蓋玻片的6 孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至50%以上融合，設不加藥為對照組、奧曲肽20 ng/mL 組、多西他賽40 μg/mL 組、聯(lián)合用藥奧曲肽20 ng/mL+多西他賽40 μg/mL 組，分別處理細胞48 h，以甲醇∶冰醋酸(3∶1)4℃固定5min，PBS 漂洗， 用終質(zhì)量濃度為5 mg/L Hoeehst33258熒光染料避光染色10 min，PBS 漂洗后滴抗熒光粹滅封片液封固;熒光顯微鏡下觀察拍照。 實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 MTT 法檢測藥物對胃癌細胞SGC-7901 細胞增殖的抑制作用

以1、5、20 ng/mL OCT 分別作用胃癌細胞SGC-7901 48 h后，MTT 結(jié)果顯示，OCT 對SGC-7901 增殖有抑制作用， 抑制作用隨著藥物濃度而增強，呈劑量依賴方式，不同濃度之間抑制率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 流式細胞儀分析聯(lián)合用藥對細胞周期及凋亡的影響

OCT 作用SGC-7901 細胞24 h 后， 經(jīng)流式細胞儀檢測可出現(xiàn)輕度S 期阻滯，并出現(xiàn)典型的凋亡峰（sub-G1），提示OCT 可通過凋亡途徑抑制胃癌細胞SGC-7901 生長。 DOC 作用于SGC-7901 細胞24 h 后， 經(jīng)流式細胞儀檢測可出現(xiàn)明顯G2 /M 期阻滯，凋亡峰明顯高于對照組（P＜0.05），提示DOC 亦可通過凋亡途徑抑制胃癌細胞SGC-7901 生長。

2.3 熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)

Hoechst33258 熒光染色后， 熒光顯微鏡下可見對照組的SGC-7901 細胞核比較完整均一，著色較淡，形態(tài)較規(guī)則，呈均勻的藍色熒光，經(jīng)奧曲肽作用細胞48h 后，細胞核偶有凋亡形態(tài)變化，經(jīng)多西他賽作用48 h 后，熒光顯微鏡下觀察到細胞大小不等，有典型的凋亡形態(tài)改變，細胞體積縮小、細胞質(zhì)濃縮、細胞核染色質(zhì)聚集，并有核碎裂及凋亡小體。 聯(lián)合用藥組可見大部分細胞質(zhì)染色不均勻，染色質(zhì)凝聚，細胞核裂解，可見凋亡小體。

3 討論

胃癌在我國為最常見的消化道惡性腫瘤，治療上采用以手術(shù)治療為主，輔以放化療等輔助治療。 化療可有效抑制和殺滅胃癌細胞，以減少復發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者生存期，改善生存質(zhì)量。 以單一藥物化療效果較差，有效率僅為20%～30%，而聯(lián)合不同作用的多種藥物則可將有效率提高到30%～50%。 因聯(lián)合用藥不但可以殺死更多癌細胞，使患者進入緩解期，而且可以有效減少腫瘤產(chǎn)生對某種藥物的耐藥性， 所以較單一用藥更受臨床醫(yī)師青睞。

該實驗顯示：奧曲肽與多西他賽聯(lián)合組腫瘤細胞抑制率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在正常血藥濃度下奧曲肽與多西他賽聯(lián)合可提高腫瘤抑制率， 奧曲肽對多西他賽有增敏作用，與奧曲肽濃度無關，提高多西他賽對腫瘤細胞的抑制作用，提示可減少多西他賽臨床用藥量。 流式細胞儀分析細胞周期顯示奧曲肽對腫瘤細胞細胞周期有輕微阻滯作用，并可誘發(fā)腫瘤凋亡。 多西他賽對胃癌細胞生長抑制作用明顯，可阻滯細胞周期與G2/M 期，誘發(fā)凋亡作用更明顯，與奧曲肽聯(lián)合應用后，導致細胞凋亡比率更高，顯示出更優(yōu)越的抗腫瘤效果。 故奧曲肽與多西他賽聯(lián)合應用于胃癌治療可減少多西他賽臨床應用劑量，從而減少多西他賽不良反應。 奧曲肽在體內(nèi)的半衰期較短，代謝速度很快，該實驗證實常規(guī)用藥劑量下，在血藥濃度變化范圍內(nèi)奧曲肽對多西他賽均有增效作用，提高了抗腫瘤治療的臨床應用效果。 另一方面，因奧曲肽對胃腸血流有減少作用，如先于多西他賽給藥，將降低多西他賽在胃腸組織內(nèi)的濃度，對抗腫瘤治療產(chǎn)生不利影響，但當多西他賽進入細胞內(nèi)后，即進入效應室后，其濃度衰減較慢，此時如給予奧曲肽，將減少胃腸血流量，減少多西他賽于胃腸組織中的清除，理論上亦可提高多西他賽抗腫瘤效果。

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