高效液相色譜－串聯(lián)質譜測定奶粉中3種苯并咪唑類藥物殘留

湯 娟，吳 斌，景 蘇，蔣 原，陳惠蘭，丁 濤，沈崇鈺

（1.南京工業(yè)大學理學院，江蘇 南京 210009；2.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001）

苯并咪唑類驅蟲劑是一類化學合成的抗蠕蟲藥物，它具有驅蟲廣譜、驅蟲效果好、毒性低等特點，不僅對成蟲，而且對幼蟲也有效。目前已經(jīng)商品化的苯并咪唑類驅蟲藥有阿苯達唑（Albendazole，AB）、奧芬達唑（Oxfendazole，OF）、芬苯達唑等（Fenbendazole，F(xiàn)B），其結構式示于圖1。雖然苯并咪唑類藥物毒性較低，但有文獻報道，阿苯達唑和奧芬達唑高劑量或長時間使用會對多種動物體的胎兒有致畸作用和胚胎毒性。世界衛(wèi)生組織，中國和歐盟規(guī)定了動物源性食品中苯并咪唑類驅蟲藥的最大殘留限量。國際食品法典委員會規(guī)定其在牛奶中的殘留限量為：阿苯達唑，芬苯達唑和奧芬達唑均為100μg/kg；歐盟規(guī)定的殘留限量為：阿苯達唑100μg/kg，芬苯達唑10μg/kg，奧芬達唑10μg/kg；我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的殘留限量與國際食品法典委員會的規(guī)定相同[1]。

目前，測定苯并咪唑類藥物的方法包括高效液相色譜－紫外檢測法[2－3]、氣相色譜－質譜聯(lián)用法和高效液相色譜－質譜聯(lián)用法[4－5]等，由于液質聯(lián)用法具有定性準確、檢測限低和無須衍生化等特點，是苯并咪唑類藥物的首選檢測方法。針對血液基 質[6－9]，生 物 組 織 樣 品[10－12]和 禽 肉 類 產(chǎn)品[13－14]，使用有機溶劑直接提取或緩沖溶液稀釋反相固相萃取凈化的方法不能完全適用于奶粉基質。本研究針對奶粉基質中含有大量蛋白和脂肪干擾物的特點，利用1%乙酸的甲醇作為提取溶液，正己烷和陽離子固相萃取兩步凈化，有效去除全脂奶粉中的抑制干擾物，取得了良好的效果。

圖1 奧芬達唑（a），阿苯達唑（b）和芬苯達唑（c）化學結構式Fig.1 Chemical structure of Oxfendazole（a），Albendazole（b）and Fenbendazole（c）

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司產(chǎn)品；API 4000Q－Trap串聯(lián)質譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；甲酸和乙酸（分析純）：南京化學試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇和乙腈（色譜純）：德國Merck公司產(chǎn)品；水為去離子水；奧芬達唑，芬苯達唑和阿芬達唑（98%）標準品：德國Dr.Eh－renstorfer GmbH 產(chǎn)品；陽離子固相萃取柱（PCX，60mg/3mL）：美國 Agela公司產(chǎn)品。

標準儲備液：分別稱取適量奧芬達唑，芬苯達唑和阿苯達唑的標準物，用含1%甲酸的甲醇溶液作為溶劑溶解上述3種標準物質，并配制成100mg/L單標儲備液，置于－4℃避光保存。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex（100mm×4.6mm×2.7μm）；流動相：A為含0.5mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3.0min，10%B；3.0～4.0min，10%～90%B；4.0～9.0min，90%B；9.0～9.5min，90%～10%B；9.5～12 min，10%B。流速：600μL/min；柱溫：35℃；進樣體積：5μL；分析時間：12min。

1.2.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子化源（ESI）；掃描模式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；電噴霧電壓：5 000V；霧化氣壓力（GS1）：320kPa；氣簾氣壓力（CUR）：160kPa；輔助 氣 流 速 （GS2）：310kPa；離 子 源 溫 度（TEM）：500℃；3種苯并咪唑類化合物的相關檢測信息列于表1。

表1 3種苯并咪唑類化合物的質譜測定參數(shù)Table 1 Mass parameters of Oxfendazole，Albendazole and Fenbendazole

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取1.0g（精確到0.01g）樣品于50mL塑料具塞離心管中，加入15mL含1%乙酸的甲醇溶液，渦旋1min，50℃水浴超聲10min，以8 000r/min高速離心，通過濾紙（中速定性）過濾。重復上述提取步驟，合并提取液于200mL玻璃圓底燒瓶中，加入30mL正己烷，振蕩10min，靜置待完全分層，去除上層正己烷后，靜置過夜沉淀。將靜置過夜后的溶液過濾，于40℃水浴旋轉蒸發(fā)至干，加入20mL水溶解殘渣（pH 約2.5）。

1.3.2 凈化 分別用3mL甲醇和水先后活化PCX小柱，將濾液過柱，并用水和甲醇先后淋洗小柱，最后用6mL含5%氨水的甲醇溶液洗脫，洗脫液氮氣吹干，用1.0mL V（乙腈）∶V（水）＝2∶8的溶液定容，過0.22μm膜，供高效液相色譜－串聯(lián)質譜分析。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

2.1.1 提取溶液的選擇 由于奧芬達唑、芬苯達唑和阿苯達唑均含有堿性疏水基團，所以它們相對易溶于極性有機溶液。由于甲醇和乙腈均有一定的蛋白沉淀效果，具有堿性基團的奧芬達唑、芬苯達唑和阿苯達唑在適當?shù)乃嵝詶l件下有更好的溶解性。在空白脫脂奶粉和全脂奶粉中分別添加濃度為10μg/kg奧芬達唑、芬苯達唑和阿苯達唑的標準溶液，比較了4種提取溶液，即乙腈、甲醇、含1%乙酸的乙腈溶液和含1%乙酸的甲醇溶液的提取回收率，結果列于表2。

表2 不同提取溶液的回收率（n＝6）Table 2 Recoveries of different extraction solutions（n＝6）

以乙腈和甲醇作為提取溶液時，阿苯達唑和芬苯達唑的回收率均很低，而使用另外兩種酸性提取溶液時，提取率有所提高，說明少量酸可以提高這3種苯并咪唑類藥物的提取效率。含1%乙酸的乙腈溶液與含1%乙酸的甲醇溶液的提取效率相差不大，但含1%乙酸的乙腈提取溶液的重復性和重現(xiàn)性相對較差，因此最終選擇含1%乙酸的甲醇為提取溶液。阿苯達唑和芬苯達唑在全脂和脫脂奶粉中的回收率較低，尤其在全脂奶粉基質中，可能存在基質抑制效應。

2.1.2 樣品基質對阿苯達唑和芬苯達唑抑制效應的確定和去除 奶粉成分較為復雜，其中包括蛋白質、脂肪、糖類、礦物質和維生素等，脫脂奶粉與全脂奶粉相比，只是脂肪含量較低，其他成分差別不大。以空白全脂奶粉為樣品，通過兩步除基質干擾過程確定可能存在的基質抑制效應，即加入正己烷和陽離子交換柱（PCX）凈化。向分離出的正己烷層和含1%乙酸的甲醇提取液中分別加入一定質量的3種混合標準溶液，濃縮近干后定容測定。在正己烷層中阿苯達唑和芬苯達唑中被測物被抑制了約49%和38%；而在含1%乙酸的甲醇提取液中，阿苯達唑和芬苯達唑的回收率約為68%和45%，表明存在基質抑制效應，而正己烷能夠除去部分基質抑制物，且對待測物幾乎沒有影響。由于在3種苯并咪唑類藥物結構中都含有伯胺基團，屬弱堿性物質，PCX固相萃取柱具有陽離子交換和反相保留混合機理，通過PCX柱進一步凈化后，阿苯達唑和芬苯達唑的回收率可提高到70%以上。

2.2 標準曲線的建立

配制濃度為2～100μg/L的6點混合標準溶液，進樣5μL，繪制標準曲線。奧芬達唑，阿苯達唑和芬苯達唑的線性回歸方程分別為：y＝43 700x－25 200，y＝136 000x－87 600，y＝14 100x＋344；線性方程系數(shù)（r）分別為：0.999 9，0.999 9和0.997 3。

2.3 檢測限、回收率和精密度

在陰性脫脂奶粉和全脂奶粉基質中添加奧芬達唑、阿苯達唑和芬苯達唑的混合標準工作液，添加水平分別為10、50和100μg/kg，重復測定6次，計算回收率和精密度，結果列于表3，譜圖示于圖2和圖3。在10μg/kg添加水平上，3種苯并咪唑類化合物的信噪比（S/N）大于10，該方法的檢測限至少可達到10μg/kg。

表3 脫脂奶粉和全脂奶粉的加標回收率（n＝6）Table 3 Recoveries in skim milk powder and whole milk powder（n＝6）

3 結論

本研究建立了采用高效液相色譜－串聯(lián)質譜測定奶粉中3種驅蟲劑（奧芬達唑、阿苯達唑和芬苯達唑）的檢測方法。樣品經(jīng)含1%乙酸的甲醇提取，正己烷和陽離子交換柱兩步凈化，通過高效液相色譜－串聯(lián)質譜法檢測，該方法的回收率、精密度和檢測限都能滿足現(xiàn)有各國檢測要求。

圖2 10μg/L標準品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 10μg/L standard Oxfendazole（tR＝6.73min），Albendazole（tR＝7.17min），F(xiàn)enbendazole（tR＝7.30min）

圖3 脫脂奶粉（a）和全脂奶粉（b）加標色譜圖Fig.3 Chromatograms of spiked in skim milk powder（a）and whole milk powder（b）

[1]岳振峰.食品中獸藥殘留檢測指南[M].北京：中國標準出版社，2010：476－497.

[2]CHIAP P，EVRARD B，BINAZUBUT M，et al.Determination of albendazole and its main metabolites in ovine plasma by liquid chromatography with dialysis as an integrated sample preparation technique[J].J Chromatogr A，2000，870：121－134.

[3]GARCáIA J，BOLáS－FERNáNDEZ F，TORRADO J.Quantitative determination of albendazole and its main metabolites in plasma[J].J Chromatogr B，1999，723：265－271.

[4]MOROVJáN G，CSOKáN P，MAKRANSZKI L，et al.Determination of fenbendazole，praziquantel and pyrantel pamoate in dog plasma by high－performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，1998，97：237－244.

[5]LANCHOTE L，MARQUES M，TAKAYANAGUI O，et al.Simultaneous determination of albendazole sulfoxide enantiomers and albendazole sulfone in plasma[J].J Chromatogr B，1998，709：273－279.

[6]劉 琪，朱馨樂，孫 雷，等.高效液相色譜－串聯(lián)質譜法檢測豬肝中苯并咪唑類藥物及其代謝物的殘留量[J].中國獸藥雜志，2010，44（2）：1－6.

[7]林永輝，李耀平，陳祥明，等.固相萃取法和凝膠滲透色譜法測定鰻魚中苯并咪唑類藥物殘留[J].食品科學，2009，30（8）：177－181.

[8]張英宣.高效液相色譜法測定牛肌肉中苯并咪唑類藥物殘留的研究[J].畜禽業(yè)，2006，198（5）：6－7.

[9]GABOR.Determination of benzimidazole residues using liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B，1999，727：167－177.

[10]郭德華，鄧曉軍，趙善貞，等.固相萃?。咝б合嗌V/串聯(lián)質譜同時檢測動物源性食品中76種獸藥殘留[J].分 析化學，2010，38（3）：318－324.

[11]JI Y H，LIU X Y，JIANG X M，et al.Oxidized multiwalled carbon nanotubes as an SPME fiber coating for rapid LC－UV analysis of benzimidazole fungicides in water[J].Chromatographia，2009，70：753－759.

[12]陳毓芳，彭肖顏.反相高效液相色譜法同時測定動物組織中苯并咪唑類獸藥殘留量[J].光譜實驗室，2001，18（5）：674－678.

[13]MENEZES FILHO A，DOS SANTOS F N，DE PAULA PEREIRA P A.Development，validation and application of a methodology based on solid－phase micro extraction followed by gas chromatography coupled to mass spectrometry（SPME/GC－MS）for the determination of pesticide residues in mangoes[J].Talanta，2010，81：346－354.

[14]RAGNO G，RISOLI A，IOELE G，et al.Photoand thermal－stability studies on benzimidazole anthelmintics by HPLC and GC－MS[J].Chem Pharm Bull，2006，54（6）：802－806.