凝膠滲透色譜－氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用快速測(cè)定大豆中克百威、乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、氟樂靈的殘留量

蘇明明，張旭東，那 晗，王 琦，宋大賀，張 寧

（1.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；2.錦州出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 錦州 121013；3.大窯灣出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；4.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116100；5.大連機(jī)場(chǎng)檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116100）

大豆是重要的油料和蛋白來源，是我國大宗進(jìn)口的農(nóng)產(chǎn)品之一?？税偻哂懈呋钚?、高效、低毒及易分解的特性，在世界范圍內(nèi)被廣泛用于保護(hù)農(nóng)作物免受蟲害。克百威是氨基甲酸酯類農(nóng)藥，在高溫中具有熱不穩(wěn)定性，在氣相色譜分析過程中，需同時(shí)測(cè)定克百威本體和其分解產(chǎn)物3－羥基克百威。目前，相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道較多，但其主要缺點(diǎn)在于操作復(fù)雜、靈敏度低等[1－4]，采用GC/MS法不僅可以同時(shí)進(jìn)行克百威的定量測(cè)定和陽性確證，還可以提高測(cè)定的靈敏度及精確度。由于豆田中雜草繁多，氟樂靈、甲草胺、異丙甲草胺和乙草胺是大豆田常用的4種除草劑，主要用于防除禾本科雜草和一些闊葉雜草，每畝的登記施用劑量均小于100g（有效成分）。我國規(guī)定大豆中異丙甲草胺的殘留限量為0.02 mg/kg，氟樂靈的殘留限量為0.05mg/kg，甲草胺和乙草胺的殘留限量皆為0.2mg/kg。由于大豆中油脂類物質(zhì)含量較高，凈化困難，試樣需采用凝膠滲透色譜（GPC）法去除色素和油脂。凝膠滲透色譜作為一種新的凈化方法和技術(shù)，在國外已廣泛使用[5－6]，在我國的運(yùn)用也日漸增多[7－10]。本研究采用凝膠滲透色譜－氣相色譜－質(zhì)譜（GPC－GC/MS）法同時(shí)檢測(cè)大豆中氟樂靈、克百威、異丙甲草胺、甲草胺和乙草胺的殘留量，去除了油脂類物質(zhì)的干擾，同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定和陽性確證，希望能為大豆中5種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供新的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

6890－5975C氣相色譜－質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有7683B自動(dòng)進(jìn)樣器和分流/不分流進(jìn)樣口；EI源及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Ultratur－Rax均質(zhì)器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司產(chǎn)品；離心機(jī) RJ－TDL－40B：中國瑞江公司產(chǎn)品；移液槍（100～1 000μL）：美國 Thermo公司產(chǎn)品；J2 AccuPrepMPS凝膠凈化色譜儀：美國J2公司產(chǎn)品。

克百威、乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺和氟樂靈（質(zhì)量濃度均為100mg/L）：購自國家環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)研究中心；流動(dòng)相為V（環(huán)己烷）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1的溶液；正己烷、乙腈、乙酸乙酯和環(huán)己烷均為分析純，經(jīng)重蒸餾后使用。

1.2 氣相色譜－質(zhì)譜條件

1.2.1 氣相色譜條件 色譜柱：HP－5MS石英毛細(xì)柱（30m×0.25mm×0.25μm）；升溫程序：80℃保持1min，以15℃/min升至270℃，保持10min；載氣（高純氦氣）流速1.2mL/min；壓力2.4kPa；進(jìn)樣口溫度270℃；進(jìn)樣量1μL；不分流進(jìn)樣。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；離子源溫度150℃，四極桿溫度230℃，色譜－質(zhì)譜接口溫度280℃；全掃描范圍m/z 50～450用于測(cè)定樣品凈化效果，選擇離子監(jiān)測(cè)用于定性和定量測(cè)定。

用乙草胺等5種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述GC/MS條件下用Scan方式先測(cè)得其總離子流圖，然后根據(jù)各農(nóng)藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖，確定各待測(cè)化合物在SIM測(cè)定方式中的采集時(shí)間和監(jiān)測(cè)離子，列于表1。

1.3 凝膠色譜（GPC）凈化

1.3.1 凝膠色譜條件 Bio Beads S－X3凈化柱：700mm×25mm；流動(dòng)相：V（環(huán)己烷）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1的混合溶液；流速：5.0 mL/min；樣品定量：5.0mL；預(yù)淋洗體積：50 mL；洗脫體積：200mL；收集體積：50mL。

表1 GC/MS－SIM法分析5種農(nóng)藥的采集時(shí)間和監(jiān)測(cè)離子Table 1 End acquisition time and monitoring ion of GC/MS－SIM analysis for 5pesiticides

1.3.2 凝膠色譜凈化步驟 將10mL待凈化液按1.3.1進(jìn)行凈化，合并餾分收集器中的收集液于250mL濃縮瓶中。

1.4 分析步驟

將大豆研碎，準(zhǔn)確稱取5.0g粉碎樣品，加入50mL乙腈，均質(zhì)2min，以4 000r/min離心10min，取乙腈層轉(zhuǎn)入100mL梨形瓶，再加入20mL乙腈重復(fù)上述提取1次，合并，于旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀中濃縮至干，加入10mL V（乙酸乙酯）∶V（環(huán)己烷）＝1∶1的混合溶液定容，過0.45μm濾膜后，用GPC凈化。收集5～15min餾分，濃縮近干，用正己烷定容至5mL，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GPC凈化方式

大豆及一些豆制品中含有大量的油脂和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，當(dāng)前最為常用的傳統(tǒng)經(jīng)典提取方法有液－液分配法、層析法、凝結(jié)沉淀法、冷凍法、化學(xué)法、薄層色譜法、掃集共蒸餾法[11－13]等。如果樣品直接提取進(jìn)樣難以除去大豆及其制品中的油脂，對(duì)色譜分析會(huì)產(chǎn)生一些干擾，影響定性定量分析的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)使用GPC進(jìn)行凈化濃縮，通過對(duì)儀器條件的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了加壓和收集特定餾分的目的，同時(shí)也縮短了試樣凈化的時(shí)間。由于GPC是依靠被分離物質(zhì)本身相對(duì)分子質(zhì)量的大小對(duì)樣品進(jìn)行分離的，凝膠本身與被分離試樣之間沒有相互作用，因此被分離物質(zhì)在分離過程中不會(huì)發(fā)生化學(xué)變化。在GPC中，大分子物質(zhì)將首先被洗脫出來，如油脂、類脂化合物、聚合物、蛋白質(zhì)、色素及類固醇等，而小分子物質(zhì)（如農(nóng)藥等）則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，較遲流出色譜柱。GPC的條件溫和，對(duì)農(nóng)藥的性質(zhì)沒有特殊要求，不同類型的農(nóng)藥可同時(shí)分析，再加上在一個(gè)固定的淋洗系統(tǒng)中，凝膠可以被反復(fù)使用，所以利用Bio－Beads S－X3凝膠填料凈化樣本中的殘留農(nóng)藥，不但技術(shù)成熟、廉價(jià)，而且重現(xiàn)性高、凈化和回收效果良好[10]。

2.2 監(jiān)測(cè)離子的選擇

在SIM測(cè)定方式中，根據(jù)各化合物的質(zhì)譜圖，選擇2～3個(gè)有足夠相對(duì)強(qiáng)度的離子作為選擇監(jiān)測(cè)離子碎片用于定量測(cè)定和陽性確證。如果分子離子峰有足夠的相對(duì)強(qiáng)度（一般大于50%），則首選分子離子峰；其次是m/z＞100的基峰或者是相對(duì)強(qiáng)度較大的其它離子碎片。

另外，克百威是氨基甲酸酯類農(nóng)藥，在高溫中具有熱不穩(wěn)定性，克百威有兩個(gè)峰出現(xiàn)，即克百威和其酚的代謝產(chǎn)物3－羥基克百威，所以克百威的測(cè)定結(jié)果為兩者之和，在SIM測(cè)定方式中設(shè)定3－羥基克百威的采集時(shí)間和監(jiān)測(cè)離子[14]。GC/MS－SIM 測(cè)定方式下5種農(nóng)藥的選擇離子流色譜圖示于圖1。

圖1 GC/MS－SIM測(cè)定方式下5種農(nóng)藥（0.1mg/L）的總離子流圖Fig.1 GC/MS－SIM ion monitoring chromatograms of 5pesticides

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

根據(jù)各農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度，取1.1節(jié)中的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷逐級(jí)稀釋，配制成5種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。其中，克百威的濃度為0.005、0.01、0.025、0.1、0.2mg/L，甲草胺的濃度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.2mg/L，乙草胺的濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L，異丙甲草胺的濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L，氟樂靈的濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L，在1.2節(jié)的 GC/MS－SIM 條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，各組分的濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.996 0～0.999 8，列于表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve of detection

2.4 方法的回收率和精密度

將大豆樣品粉碎后，在大豆粉末中添加克百威、氟樂靈、甲草胺、異丙甲草胺和乙草胺進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度重復(fù)6次，得出農(nóng)藥回收率為66.26%～104.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～12.3%。本試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)添加的最低質(zhì)量濃度為0.01mg/L，5種農(nóng)藥的信噪比均大于10，并有較好的回收率，故確定各農(nóng)藥定量限為0.01mg/L，結(jié)果列于表3。

表3 5種農(nóng)藥樣品的加標(biāo)回收率及精密度Table 3 Recoveries and precisions of 5pesticides at different spiked concentrations

2.5 實(shí)樣檢測(cè)

自2010年4月以來，采用本方法檢測(cè)了大量的大豆樣品。對(duì)其中一批陽性樣品進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果為乙草胺，平均值為0.03 mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%，其對(duì)應(yīng)的色譜圖示于圖2～4。

圖2 空白大豆樣品總離子色譜圖Fig.2 SIM chromatograms of soybean sample

圖3 陽性大豆樣品總離子色譜圖Fig.3 SIM chromatograms of positive soybean sample

圖4 0.1mg/L乙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子色譜圖Fig.4 SIM chromatograms of 0.1mg/L acetochlor

3 結(jié)論

雖然檢測(cè)大豆中克百威、異丙甲草胺、氟樂靈、甲草胺和乙草胺的農(nóng)藥殘留已有國家標(biāo)準(zhǔn)和其他檢測(cè)方法[15－18]，但需要對(duì)5種農(nóng)藥分別進(jìn)行檢測(cè)，花費(fèi)時(shí)間比較長。GPC結(jié)合GC/MS－SIM法可以對(duì)大豆中5種農(nóng)藥殘留同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定和陽性確證，達(dá)到了一舉兩得，事半功倍的效果，避免了氣相色譜法中當(dāng)干擾物的保留時(shí)間與被測(cè)物非常接近時(shí)而引起的陽性判斷錯(cuò)誤。GC/MS法中的SIM測(cè)定方式基線噪聲小、干擾少、具有與GC－FPD或GC－NPD法相當(dāng)或者更高的靈敏度；測(cè)定克百威、異丙甲草胺、氟樂靈、甲草胺和乙草胺5種農(nóng)藥殘留的檢出限量完全可以滿足檢測(cè)要求。

試樣用乙腈提取，GPC進(jìn)行前處理，回收率、精密度較好、簡(jiǎn)捷、快速，適用于在短時(shí)間內(nèi)大批量樣品的分析。

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