飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜在生物材料和生命科學(xué)中的應(yīng)用（上）

孫立民

（上海交通大學(xué)分析測試中心，上海 200240）

在生物和生命科學(xué)領(lǐng)域中常常需要對(duì)多肽、蛋白質(zhì)、DNA、細(xì)胞組織、脂質(zhì)、多糖等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和含量進(jìn)行表征，而許多化學(xué)和生化分析技術(shù)能夠滿足這樣的分析要求。但是，當(dāng)這些生物生命物質(zhì)分布在表面或界面時(shí)，所能勝任的分析手段就局限在表面分析技術(shù)。通常需要表征的表面特性包括化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)、分子取向、不同組分的空間分布以及在生物材料表面上存留的生物分子等[1－2]。在常見的用于化學(xué)分析的表面分析技術(shù)中，飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜（TOF－SIMS）由于自身所具有的特點(diǎn)，包括結(jié)構(gòu)識(shí)別、出色的檢出限、高的表面靈敏度及其在微米及納米尺度上的空間分辨率等，決定了它在生命物質(zhì)的表征方面具有優(yōu)異而又獨(dú)特的功用。TOF－SIMS能夠?qū)ξ镔|(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，由于它提供的信息深度在一個(gè)分子層內(nèi)，這決定了它適合做表面的結(jié)構(gòu)分析，并且具有很高的表面靈敏度。這一特性使它區(qū)別于其它分析固體樣品的質(zhì)譜技術(shù)，包括與其相近的基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDIMS）。TOF－SIMS具有10－6級(jí)的檢出限，高的質(zhì)量分辨率及優(yōu)異的同位素分辨能力。除此之外，TOF－SIMS還具有化學(xué)成像（chemical mapping）及深度剖析（depth profiling）的功能，因此可以提供元素和分子的空間分布信息。在TOF－SIMS剛剛被發(fā)明使用的20世紀(jì)70年代，它就被用來嘗試性地分析生物分子[3]；90年代開始較為廣泛地被應(yīng)用于生命領(lǐng)域的研究；近10年來，儀器性能的不斷改進(jìn)，特別是團(tuán)簇離子源的發(fā)明和使用，使得分子離子的二次離子產(chǎn)額及空間分辨率有了較大的改善。大量的應(yīng)用文獻(xiàn)表明，TOF－SIMS技術(shù)在生命領(lǐng)域的研究已成為“常規(guī)性”的測試手段。應(yīng)用研究的內(nèi)容包括蛋白質(zhì)吸附、蛋白質(zhì)化學(xué)法接枝到襯底表面（定量及空間取向）、組織切片、單細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)及其中的生物組分分布（包括磷酸脂，碳?xì)浠衔?，氨基酸，多肽及痕量重金屬元素等）、生物芯片（包括DNA，多糖和多肽芯片）、生物傳感器、藥物釋放機(jī)制、疾病診斷、體內(nèi)移植材料設(shè)計(jì)及改性等科學(xué)問題。

TOF－SIMS檢測的基本原理是基于帶有幾千電子伏特能量的一次離子束轟擊固體樣品表面，經(jīng)過物理相互作用而使樣品表面產(chǎn)生二次離子的現(xiàn)象[4－5]。高速一次離子束撞擊到樣品表面時(shí)，導(dǎo)致碎片在撞擊區(qū)域產(chǎn)生。這些碎片中大部分是中性碎片，還有帶正電荷和帶負(fù)電荷的碎片，這些帶電荷的碎片離子被稱為二次離子。當(dāng)一次離子束與樣品表面撞擊而發(fā)生作用時(shí)，能夠逃逸到真空中的二次離子中只來源于樣品的最表面。因此，被收集并檢測到的二次離子所反映的信息也僅僅針對(duì)樣品的最表層，這就決定了TOF－SIMS是一種表面分析技術(shù)。另外，在對(duì)有機(jī)樣品做分析時(shí)，儀器的操作條件必須符合靜態(tài)條件，即一次離子束流密度小于1012ions/s·cm。靜態(tài)條件可以保證二次離子被檢測出時(shí)樣品尚未被一次離子束流破壞。檢測的信息深度在一個(gè)分子層范圍內(nèi)，即約為10～20?。TOFSIMS儀器結(jié)構(gòu)簡單的講可分為飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測器、一次離子源及超高真空檢測腔部分。儀器具體構(gòu)造及儀器改進(jìn)的歷史已經(jīng)在許多文章[4，6－8]中介紹，在此不再敘述。

自第一臺(tái)TOF－SIMS儀器由德國的Benninghoven發(fā)明以來至今，儀器硬件的制作日趨完善。目前的儀器可以具有10－6級(jí)檢出限，有出色的深度和橫向分辨能力（深度可達(dá)1nm，XY可達(dá)100nm）。其中一次離子源也不斷更新，從而大大改進(jìn)了TOF－SIMS的使用性能。特別值得一提的是團(tuán)簇源的發(fā)明（比如SF6、Aun、Bin及C60團(tuán)簇源等）。使用團(tuán)簇源作為一次離子源大大提高了二次離子的產(chǎn)額，特別是分子離子的二次離子產(chǎn)額，從而增強(qiáng)了TOF－SIMS對(duì)有機(jī)分子檢測的靈敏度和結(jié)構(gòu)認(rèn)定能力。二次離子產(chǎn)額的提高同時(shí)間接地提高了空間分辨率，而使得化學(xué)成像功能得到改善。另外，采用團(tuán)簇源作為濺射源增加了TOF－SIMS進(jìn)行生物體的深度剖析或三維成像分析的潛力。

TOF－SIMS在生物材料研究領(lǐng)域中也獲得了廣泛的應(yīng)用[9－12]。在此，將著重 圍繞 TOFSIMS的3種基本分析功能，分別例舉它們?cè)谏锊牧项I(lǐng)域的典型應(yīng)用實(shí)例，包括蛋白質(zhì)吸附機(jī)制、單個(gè)細(xì)胞、組織切片、藥物釋放機(jī)理、生物芯片、體內(nèi)移植材料設(shè)計(jì)與改性等。另外，也將簡略介紹TOF－SIMS分析方法自身存在的難題，如定量分析和數(shù)據(jù)解析以及相應(yīng)的解決方法和策略。為了結(jié)構(gòu)清晰，完整的綜述（上下兩篇）劃分為4部分：有機(jī)質(zhì)譜，化學(xué)成像，深度剖析以及TOF－SIMS在生物生命材料領(lǐng)域應(yīng)用的展望。本篇將介紹應(yīng)用有機(jī)質(zhì)譜對(duì)生物醫(yī)用高分子材料和生物分子的結(jié)構(gòu)表征及研究相關(guān)的科學(xué)問題，包括蛋白質(zhì)吸附，生物材料表面化學(xué)改性和生物降解高分子藥物釋放機(jī)理。

1 有機(jī)質(zhì)譜：化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒別

TOF－SIMS譜圖和其他質(zhì)譜圖一樣，可以提供化學(xué)結(jié)構(gòu)的信息；所不同的是，SIMS的信息來源僅限于表面，質(zhì)譜圖中的譜峰來自表面存在的所有成分，也就是說TOF－SIMS的譜圖是混合物的譜圖。因此在對(duì)TOF－SIMS譜圖分析時(shí)必須對(duì)樣品表面的主要化學(xué)成分有一定的了解。另外，TOF－SIMS的二次離子產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及到一次離子束與固體表面相互作用的過程。有關(guān)分子二次離子的產(chǎn)生假說包括碰撞級(jí)聯(lián)模型（collision cascade models），又分為經(jīng)典動(dòng)力學(xué)模型（classical dynamics model）、“先存離子”模型（precursor model）和熱振動(dòng)模型（thermal and vibrational models）[13]。一般說來SIMS譜圖中的譜峰可分為幾種，包括無特征性小碎片峰；有特征性的碎片峰；分子離子峰（如[M＋H]＋，[M－H]－），金屬螯合離子峰及團(tuán)簇離子峰。一般來講在低質(zhì)量數(shù)范圍里，主要是無特征性及有特征性小碎片離子峰。一個(gè)有機(jī)分子化學(xué)式可以通過有特征的小碎片峰及分子特征峰來確定。而從高分子SIMS譜圖中可以獲得的信息包括重復(fù)單元，末端基結(jié)構(gòu)化學(xué)式，分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布等[14]。

1.1 生物醫(yī)用有機(jī)高分子材料

一些合成高分子材料由于具有化學(xué)惰性、生物相容性、生物降解性而被用作生物醫(yī)學(xué)材料。常見的高分子材料包括聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸脂、聚氨酯、聚四氟乙烯和對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等。生物相容性是這些材料作為醫(yī)用材料的重要特性，而從開始設(shè)計(jì)材料表面時(shí)生物相容性就需要考慮。生物材料最表層的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)、污染物、元素和分子的富集等因素都會(huì)影響其生物反應(yīng)及長期的穩(wěn)定性能[2]。因而，材料表面化學(xué)的表征對(duì)于材料設(shè)計(jì)及質(zhì)量檢驗(yàn)都是必要的。

對(duì)高分子的結(jié)構(gòu)分析包括分子主鏈、側(cè)鏈基及末端基的結(jié)構(gòu)表征和分子質(zhì)量、分子質(zhì)量分布的確定[1，5]。圖1是幾種聚丙烯酸甲酯高分子的負(fù)離子SIMS譜圖[1]?？梢钥闯觯?個(gè)譜圖都顯示了代表主鏈的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的m/z 85峰（C4H5O2）。同時(shí)，在譜圖上標(biāo)識(shí)出4種高分子側(cè)鏈碎片峰的元素組成，如C2H5O、C2H5O2、C4H9O、C6H5O。對(duì)于未知樣品可以借助高分子材料的 SIMS譜圖手冊(cè)[14－15]，參照其中標(biāo)準(zhǔn)譜圖中的“指紋”部分來加以分析。另外，可以使用質(zhì)譜學(xué)中常規(guī)的結(jié)構(gòu)演推方法（可以參考McLafferty經(jīng)典著作[16]），通過識(shí)別碎片峰和其形成途徑來確定分子結(jié)構(gòu)[1]。共聚高分子或共混高分子表面化學(xué)成分的富集現(xiàn)象也可用TOF－SIMS來研究。共聚高分子或共混高分子中的兩種組分的表面能有很大差異，具有低表面能的鏈段或組分傾向于表面富集，即它們的成分在表面的相對(duì)含量遠(yuǎn)高于體相中的濃度，如聚二甲基硅氧烷鏈段（PDMS），含氟的碳?xì)浞肿渔湺蝃17－19]。是否在表面有富集現(xiàn)象的發(fā)生可以通過比較兩種組分的SIMS峰強(qiáng)比值在體相和表面上是否存在差異來判斷[5，19]。

1.2 氨基酸，多酞，蛋白質(zhì)

電噴霧－質(zhì)譜（ESI－MS）和 MALDI－MS質(zhì)譜技術(shù)常用于氨基酸，多酞，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表征[20]。相比于這些在生化分析中常規(guī)使用的質(zhì)譜技術(shù)，TOF－SIMS具有樣品制備簡單、檢測靈敏度高、可以表面成像等特點(diǎn)。早在儀器發(fā)明初期，科學(xué)家們就使用它表征放置在金屬銀襯底上的氨基酸和多肽化合物[21]。以后 Mantus和Ratner應(yīng)用四極桿SIMS對(duì)多肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)測定做了嘗試性的研究[22]。在 Mantus的工作中，采集了16種單一組分多肽高分子SIMS譜圖，從中總結(jié)出對(duì)應(yīng)于每種氨基酸的特征峰，列于表1。借助這個(gè)特征峰表，Mantus使用靜態(tài)SIMS對(duì)蛋白質(zhì)（包括albumin，F(xiàn)ribrogen和insulin）在鈦金屬和硅襯底上的吸附現(xiàn)象做定性研究。Samul等[23]使用TOF－SIMS測量了15種氨基酸聚合物。與Mantus的工作相比，Samul得到的譜圖具有更好的質(zhì)量分辨率和更高的靈敏度。

圖1 幾種聚甲基丙烯酸甲酯高分子的負(fù)性離子指紋區(qū)譜圖由高分子側(cè)鏈基團(tuán)從高分子骨架上斷裂而形成的特征碎片離子峰在圖中由箭頭標(biāo)識(shí)出來[1]Fig.1 Fingerprint region of the negative ion spectrum for several methacrylate polymers

Sole－Domenech 在 最 近 的 《Analytical Chemistry》雜志上[24]，較為詳盡地報(bào)道了使用Bi3和Au3為一次離子源對(duì)兩種多肽分子（Opioid和Amyloid）做氨基酸序列分析。結(jié)果表明：在低質(zhì)量數(shù)區(qū)域，可以檢測到單個(gè)氨基酸的特征峰；在中、高質(zhì)量數(shù)區(qū)域，可以檢測到對(duì)應(yīng)于多個(gè)氨基酸的碎片峰及分子離子峰。另外，還發(fā)現(xiàn)TOF－SIMS譜圖的碎片峰分布輪廓與碰撞誘導(dǎo)解離 （collision－induced dissociation，CID）的檢測結(jié)果相似。因而Sole－Domenech等認(rèn)為使用Bi3和Au3團(tuán)簇一次離子源，可以推進(jìn)TOFSIMS在蛋白組學(xué)中的應(yīng)用。在TOF－SIMS定量分析多肽的研究中，Sun等[25]應(yīng)用 TOFSIMS進(jìn)行了多肽藥物分子在大氣及臭氧環(huán)境下的固相氧化反應(yīng)初始階段的動(dòng)力學(xué)研究。在這項(xiàng)工作中，選用負(fù)性分子離子峰做相對(duì)定量分析。通過使用氧化產(chǎn)物與反應(yīng)物分子離子峰強(qiáng)度比值及標(biāo)準(zhǔn)曲線得出了表觀動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)。結(jié)合X射線光電子能譜（XPS），Apte等研究了兩種模型低聚多肽分子（14－merα－h(huán)elix和15－merβ－strand oligopeptides）在自主膜（SAM）上的吸附。通過對(duì)比分析不同吸附情況下亮氨酸（L）和賴氨酸（K）的特征峰強(qiáng)比值，說明兩種多肽分子在親水性和疏水性表面所呈現(xiàn)的形態(tài)不同[26]。

蛋白質(zhì)吸附是人工材料放置到生物環(huán)境中所發(fā)生的第一個(gè)生物反應(yīng)現(xiàn)象。材料表面特性決定了蛋白質(zhì)在表面上吸附的類型、數(shù)量、取向和形態(tài)以及空間分布[1]。因而，為了更好地了解人工生物材料的功能及如何控制生物環(huán)境與材料之間的反應(yīng)，需要對(duì)蛋白質(zhì)吸附過程中形成的蛋白質(zhì)（膜）的表面結(jié)構(gòu)及成分做微觀的表征。在過去近30年，TOF－SIMS已經(jīng)被較為廣泛地用于這方面的研究[11]。美國華盛頓大學(xué)的Castner和Ratner在這個(gè)領(lǐng)域中做了大量的研究工作[11，27]。由于 TOF－SIMS的檢測深度在10～20?，而蛋白質(zhì)（膜）的厚度約10μm左右。因此，TOF－SIMS不能直接檢測到蛋白質(zhì)分子離子峰，而是碎片離子峰[4，11]，這使譜圖數(shù)據(jù)分析工作復(fù)雜并且龐大。為了解決這個(gè)問題，Castner采用多變量方法（multivariate analysis，MVA）輔 助 處 理 蛋 白 質(zhì)譜 圖 數(shù) 據(jù)[27－28]。應(yīng) 用TOF－SIMS技術(shù)并結(jié)合MVA方法進(jìn)行了定量分析[29－30]、蛋白質(zhì)表征及分類[31]、蛋白質(zhì)膜的形態(tài)和取向[32]等方面的研究。在近一二十年里，應(yīng)用TOF－SIMS做蛋白質(zhì)研究較為活躍。研究的內(nèi)容包括蛋白質(zhì)表面取向和形態(tài)表征[32－34]，蛋白質(zhì)吸附的定量分析[35－36]，使用主成分分析法（principal component analysis，PCA）（如圖2）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法區(qū)分不同蛋白質(zhì)[37－38]；評(píng)估蛋白質(zhì)與不同種金屬襯底的鍵合能力[39]，吸附環(huán)境（襯底，溫度等因素）對(duì)蛋白質(zhì)吸附的影響[33，40]等。

表1 16種氨基酸均聚物的正性SIMS離子特征碎片峰一覽表[22]Table 1 Summary of characteristic fragment ions in the positive SIMS spectra of homopolymers of 16Amino acids[22]

1.3 核苷酸，DNA，磷脂膜及多糖[41－45]

May等[43]使用 XPS并結(jié)合 TOF－SIMS分析DNA的構(gòu)成成分。在TOF－SIMS譜圖中代表核酸堿基、核苷和核苷酸的特征正負(fù)離子峰可以被識(shí)別出來。通過單變量或多變量分析方法，可以區(qū)分組分非常相近的兩個(gè)DNA低聚物（oligomer）。在這項(xiàng)工作中，作者建立特征分子離子峰的數(shù)據(jù)表，并將表中的特征分子離子峰作為標(biāo)準(zhǔn)譜峰，應(yīng)用于預(yù)測較為復(fù)雜DNA分子中堿基的相對(duì)含量。Prinz等研究了3種磷脂模型結(jié)構(gòu)，冷凍干燥制備的 支撐 1－oleoyl－2－palmitoylsn－glycero－3－phosphocholine （POPC）雙 分 子膜、Langmuir－Blodgett POPC單分子膜以及無序的POPC厚膜[44]。通過對(duì)比雙分子膜與后兩種膜的譜圖，發(fā)現(xiàn)雙分子膜譜圖中的POPC分子離子峰和雙分子離子峰比其他兩種膜高出5～10倍。由此作者提出采用此現(xiàn)象來作為推斷在細(xì)胞或組織切片上磷脂的雙分子膜是否存在的依據(jù)。糖類分子由于結(jié)構(gòu)相似，特征譜峰也十分相似。因而，導(dǎo)致TOF－SIMS不易區(qū)分不同種類的糖分子。但是借助MVA手段輔助處理譜圖數(shù)據(jù)，Berman等成功地區(qū)分幾種含單一組分的糖分子同構(gòu)體[45]，并且識(shí)別出各種同構(gòu)體的重要離子峰。這項(xiàng)研究成果表明，TOF－SIMS與PCA的結(jié)合可以提供對(duì)生命材料細(xì)微差別的觀測，從而渴望能夠被應(yīng)用研究細(xì)胞過程中生物現(xiàn)象及作為疾病的診斷手段[45]。

圖2 蛋白質(zhì)的TOF－SIMS正性離子譜圖的PCA得分圖（PC 1對(duì)PC 2）[38]Fig.2 PCA Score plot（PC 1 vs PC 2）of the positive ion ToF－SIMS spectra of the proteins adsorbed onto silicon wafer substrates from 100mg/L single protein solutions[38]

1.4 生物材料表面化學(xué)改性

由于TOF－SIMS兼有表面分析和質(zhì)譜分析的功能，因而，對(duì)研究生物材料表面改性的應(yīng)用顯得最為直接和理所當(dāng)然。Todd[47]設(shè)計(jì)多步法合成制備酶－響應(yīng)表面或稱為“聰明”的生物材料表面，將具有粘接細(xì)胞性能的多肽分子RGD與在玻璃襯底上PEG鏈段形成化學(xué)鍵合，從而使多肽分子RGD被固定在表面上。在這個(gè)研究中TOF－SIMS被用來驗(yàn)證每一步的化學(xué)接枝/鍵合反應(yīng)。Ti材料作為優(yōu)良的人工體內(nèi)移植材料（比如骨骼）已經(jīng)被廣泛使用。為了增強(qiáng)其與骨頭的鍵合強(qiáng)度，Adden在Ti表面上首先形成磷酸單分子層，進(jìn)而通過與磷酸鍵合引進(jìn)生物活性分子，比如BMP－2蛋白質(zhì)到Ti材料表面。使用XPS和TOF－SIMS來表征并驗(yàn)證磷酸單分子膜的形成[49]。Kalaskar[50]采用化學(xué)方法將不同種類氨基酸分子接枝到纖維素表面，目的是使改性過的表面能夠影響纖維原細(xì)胞（fibroblast cell）的形貌及其細(xì)胞伸展。TOFSIMS譜圖技術(shù)用來檢驗(yàn)氨基酸的接枝效率并驗(yàn)證末端基Fmoc的存在。

1.5 生物降解高分子藥物釋放機(jī)理

高分子材料的生物降解性能使得它們可以用于可控制藥物釋放的載體。為了設(shè)計(jì)具有可控藥物釋放性能的材料，需要對(duì)高分子降解及同時(shí)發(fā)生的藥物釋放機(jī)制有較清楚的認(rèn)識(shí)[51]。Gardella課題組開展應(yīng)用TOF－SIMS對(duì)聚（α－羥基酸）類型高分子表面水解動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)性研究[52－54]，示于圖3。圖3是 PGA 膜水解動(dòng)力學(xué)研究的TOF－SIMS譜圖，其中圖3a為水解處理之前；圖3b、圖3c均為水解處理之后，圖3b的水解時(shí)間為2h，圖3c的水解時(shí)間為6h。水解條件為：緩沖溶液pH 7.4，溫度37℃。使用TOF－SIMS檢測不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)在表面的水解產(chǎn)物（低聚物）的分子離子峰分布，進(jìn)而計(jì)算出低聚物的平均分子質(zhì)量。水解反應(yīng)速度最終從表面的水解產(chǎn)物（低聚物）平均分子質(zhì)量與水解時(shí)間的定量關(guān)系曲線中獲得。Chen和Gardella研究了聚乙醇酸（PGA）材料的水解動(dòng)力學(xué)與溶液pH值大小的關(guān)系[52]。Lee和Gardella研究了PGA薄膜（約100μm）的近表面的體外水解降解動(dòng)力學(xué)行為[54]。

圖3 PGA膜的正性TOF SIMS譜圖星號(hào)標(biāo)識(shí)的離子峰系列為最強(qiáng)的二次離子分布[54]Fig.3 Positive ToF SIMS spectra of PGA films[54]

2 小結(jié)

TOF－SIMS作為一種質(zhì)譜技術(shù)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）樣品制備簡單，無需樣品提純，樣品用量少[24]；2）質(zhì)量準(zhǔn)確度高，可以通過同位素分布擬合準(zhǔn)確確定分子式；3）表面靈敏度高（10～20 ?深度內(nèi)），檢出限低（10－6量級(jí)）。這些優(yōu)點(diǎn)使得TOF－SIMS對(duì)于在表面上分布的生物分子進(jìn)行化學(xué)成分表征及結(jié)構(gòu)鑒定方面相比與其他質(zhì)譜技術(shù)如（ESI－MS和 MALDI－MS）都有很大的競爭力。另外，像任何一種分析技術(shù)一樣，TOFSIMS也有其弱點(diǎn)：1）定量分析困難。由于存在“基質(zhì)效應(yīng)”，對(duì)于定量分析不能采用像響應(yīng)因子的方法來實(shí)現(xiàn)；2）譜圖數(shù)據(jù)分析較為困難。一是由于有機(jī)分子離子化及形成碎片機(jī)理依然不是十分清楚，因而對(duì)未知樣品的結(jié)構(gòu)分析困難；二是大多數(shù)情況下譜圖中的譜峰來自混合物，因而增加了數(shù)據(jù)解析的難度；3）儀器價(jià)格相對(duì)昂貴。

為了克服這些技術(shù)弱點(diǎn)，增強(qiáng)TOF－SIMS使用性，需要擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)化合物的譜圖數(shù)據(jù)庫，降低儀器成本。另外，雖然“基質(zhì)效應(yīng)”決定了TOF－SIMS自身定量分析的困難性，但就某些研究體系，采用峰比值法[25，55]、內(nèi)標(biāo)法[56]、標(biāo)準(zhǔn)曲線法[25]、MVA 輔助法[30]，借助其它分析技術(shù)（比如 XPS）的輔證法[5，29]，可以實(shí)現(xiàn)可靠的相對(duì)定量分析。

[1]BELU A M，GRAHAM D J，CASTNER D G.Time－of－flight secondary ion mass spectrometry：techniques and applications for the characterization of biomaterial surfaces[J].Biomaterials，2003，24（21）：3 635－3 653.

[2]SABBATINI L，ZAMBONIN P G.XPS and SIMS surface chemical analysis of some important classes of polymeric biomaterials[J].Journal of Electron Spectroscopy and Related Phenomena，1996，81（3）：285－301.

[3]BENNINGHOVEN A.Detection，identification and structural investigation of biologically important compounds by secondary ion mass spectrometry[J].Analytical Chemistry，1978，50（8）：1 180－1 184.

[4]VICKERMAN J C，BRIGGS D.TOF－SIMS：Sur－face analysis by mass spectrometry[M].Chichester：IM，2001.

[5]VAN VAECK L，ADRIAENS A，GIJBELS R.Static secondary ion mass spectrometry：（S－SIMS）Part 1.Methodology and structural interpretation[J].Mass Spectrometry Reviews，1999，18（1）：1－47.

[6]BRIGGS D.聚合物表面分析 X射線光電子譜（XPS）和靜態(tài)次級(jí)離子質(zhì)譜（SSIMS）[M].曹立禮，鄧宗武，譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

[7]貝寧豪文A，查良鎮(zhèn).飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜——強(qiáng)有力的表面、界面和薄膜分析手段[J].真空，2002，（5）：10－14.

[8]周 強(qiáng)，李金英，梁漢東，等.二次離子質(zhì)譜（SIMS）分析技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2004，25（2）：113－120.

[9]BOXER S G，KRAFT M L，WEBER P K.Advances in imaging secondary ion mass spectrometry for biological samples[J].Annual Review of Biophysics，2009，38：53－74.

[10]LEE T G，PARK J W，SHON H K，et al.Biochemical imaging of tissues by SIMS for biomedical applications[J].Applied Surface Science，2008，255（4）：1 241－1 248.

[11]MICHEL R，CASTNER D G.Advances in timeof－flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein films[J].Surface and Interface Analysis，2006，38（11）：1 386－1 392.

[12]WALKER A V.Why is SIMS underused in chemical and biological analysis challenges and opportunities[J].Analytical Chemistry，2008，80（23）：8 865－8 870.

[13]PACHUTA S J，COOKS R G.Mechanisms in molecular SIMS[J].Chemical Reviews，1987，87（3）：647－669.

[14]NEWMAN J G，HOHLT T A.Static SIMS handbook of polymer analysis：A reference book of standard data for identification and interpretation of static SIMS data[M].Eden Prairie，Minn：Perkin－Elmer Corp，Physical Electronics Division，1991.

[15]BRIGGS D，BROWN A，VICKERMAN J C.Handbook of static secondary ion mass spectrometry：[（SIMS）][M].Chichester：Wiley，1989.

[16]MCLAFFERTY F W，TURECEK F.Interpretation of mass spectra[M].Mill Valley，Calif：University Science Books，1993.

[17]GARDELLA J A，MAHONEY C M.Determi－nation of oligomeric chain length distributions at surfaces using TOF－SIMS：Segregation effects and polymer properties[J].Applied Surface Science，2004，231－2：283－288.

[18]HOOK D J，VALINT P L，CHEN L，et al.Quantitative and high mass TOF－SIMS studies of siloxane segregation in hydrogel polymers using cryogenic sample handling techniques[J].Applied Surface Science，2006，252（19）：6 679－6 682.

[19]CHEN J，GARDELLA JR J A.Solvent effects on the surface composition of poly（dimethylsiloxane）－co－polystyrene/polystyrene blends [J].Macromolecules，1998，31（26）：9 328－9 336.

[20]趙玉芬.生物有機(jī)質(zhì)譜[M].鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2005.

[21]BENNINGHOVEN A，SICHTERMANN W K.Detection，identification，and structural investigation of biologically important compounds by secondary ion mass spectrometry[J].Analytical Chemistry，1978，50（8）：1 180－1 184.

[22]MANTUS D S，RATNER B D，CARLSON B A，et al.Static secondary ion mass spectrometry of adsorbed proteins[J].Analytical Chemistry，1993，65（10）：1 431－1 438.

[23]SAMUEL N T，WAGNER M S，DORNFELD K D，et al.Analysis of poly（amino acids）by static time－of－flight secondary ion mass spectrometry（TOF－SIMS）[J].Surface Science Spectra，2001，8（3）：163－184.

[24]SOLE－DOMENECH S，JOHANSSON B，SCHALLING M，et al.Analysis of opioid and amyloid peptides using time－of－flight secondary ion mass spectrometry[J].Analytical Chemistry，2010，82（5）：1 964－1 974.

[25]SUN L M，GARDELLA J A.The solid state oxidation of methionine containing peptide：A preliminary study using time of flight secondary ion mass spectrometry[J].Pharmaceutical Research，2000，17（7）：859－862.

[26]APTE J S，COLLIER G，LATOUR R A，et al.XPS and TOF－SIMS investigation of a－h(huán)elical and β－strand peptide adsorption onto SAMs[J].Langmuir，2010，26（5）：3 423－3 432.

[27]LHOEST J B，WAGNER M S，TIDWELL C D，et al.Characterization of adsorbed protein films by time of flight secondary ion mass spectrometry[J].Journal of Biomedical Materials Research，2001，57（3）：432－440.

[28]GRAHAM D J，WAGNER M S，CASTNER D G.Information from complexity：Challenges of TOF－SIMS data interpretation[J].Applied Surface Science，2006，252（19）：6 860－6 868.

[29]WAGNER M S，SHEN M，HORBETT T A，et al.Quantitative analysis of binary adsorbed protein films by time of flight secondary ion mass spectrometry[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A，2003，64A（1）：1－11.

[30]WAGNER M S，SHEN M，HORBETT T A，et al.Quantitative time－of－flight secondary ion mass spectrometry for the characterization of multicomponent adsorbed protein films[J].Applied Surface Science，2003，203：704－709.

[31]WAGNER M S，CASTNER D G.Analysis of adsorbed proteins by static time－of－flight secondary ion mass spectrometry[J].Applied Surface Science，2004，231－232：366－376.

[32]XIA N，MAY C J，MCARTHUR S L，et al.Time－of－flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films[J].Langmuir，2002，18（10）：4 090－4 097.

[33]MICHEL R，PASCHE S，TEXTOR M，et al.Influence of PEG architecture on protein adsorption and conformation[J].Langmuir，2005，21（26）：12 327－12 332.

[34]BAUGH L，WEIDNER T，BAIO J E，et al.Probing the orientation of surface－immobilized protein G B1using TOF－SIMS，sum frequency generation，and NEXAFS spectroscopy[J].Langmuir，2010，26（21）：16 434－16 441.

[35]KIM Y P，HONG M Y，KIM J，et al.Quantitative analysis of surface－immobilized protein by TOF－SIMS：Effects of protein orientation and trehalose additive[J]. Analytical Chemistry，2007，79（4）：1 377－1 385.

[36]HENRY M，BERTRAND P.Influence of polymer surface hydrophilicity on albumin adsorption[J].Surface and Interface Analysis，2004，36（8）：729－732.

[37]CANAVAN H E，GRAHAM D J，CHENG X H，et al.Comparison of native extracellular matrix with adsorbed protein films using secondary ion mass spectrometry[J].Langmuir，2007，23（1）：50－56.

[38]SANNI O D，WAGNER M S，BRIGGS D，et al.Classification of adsorbed protein static TOFSIMS spectra by principal component analysis and neural networks[J].Surface and Interface Analysis，2002，33（9）：715－728.

[39]SUZUKI N，GAMBLE L，TAMERLER C，et al.Adsorption of genetically engineered proteins studied by time－of－flight secondary ion mass spectrometry（TOF－SIMS）.Part A：Data acquisition and principal component analysis （PCA）[J].Surface and Interface Analysis，2007，39（5）：419－426.

[40]COLE M A，JASIENIAK M，THISSEN H，et al.Time－of－flight－secondary ion mass spectrometry study of the temperature dependence of protein adsorption onto poly （N－isopropylacrylamide）graft coatings[J].Analytical Chemistry，2009，81（16）：6 905－6 912.

[41]LINTON R，GUARISCO V，LEE J J，et al.Analytical surface spectroscopy of phospholipid langmuir－blodgett－films[J].Thin Solid Films，1992，210（1/2）：565－570.

[42]PATRICK J S，COOKS R G，PACHUTA S J.Analysis of nucleotides and oligonucleotides immobilized as self－assembled monolayers by static secondary ion mass spectrometry[J].Biological Mass Spectrometry，1994，23（11）：653－659.

[43]MAY C J，CANAVAN H E，CASTNER D G.Quantitative X－ray photoelectron spectroscopy and time－of－flight secondary ion mass spectrometry characterization of the components in DNA[J].Analytical Chemistry，2004，76（4）：1 114－1 122.

[44]PRINZ C，H??K F，MALM J，et al.Structural effects in the analysis of supported lipid bilayers by time－of－flight secondary ion mass spectrometry[J].Langmuir，2007，23（15）：8 035－8 041.

[45]BERMAN E S F，KULP K S，KNIZE M G，et al.Distinguishing monosaccharide stereo－and structural isomers with TOF－SIMS and multivariate statistical analysis[J].Analytical Chemistry，2006，78（18）：6 497－6 503.

[46]KALASKAR D M，GOUGH J E，ULIJN R V，et al.Controlling cell morphology on amino acidmodified cellulose[J].Soft Matter，2008，4（5）：1 059－1 065.

[47]TODD S J，SCURR D J，GOUGH J E，et al.Enzyme－activated RGD ligands on functionalized poly（ethylene glycol）monolayers：Surface analy－sis and cellular response[J].Langmuir，2009，25（13）：7 533－7 539.

[48]VIORNERY C，CHEVOLOT Y，LEONARD D，et al.Surface modification of titanium with phosphonic acid to improve bone bonding：Characterization by XPS and TOF－SIMS[J].Langmuir，2002，18（7）：2 582－2 589.

[49]ADDEN N，GAMBLE L J，CASTNER D G，et al.Phosphonic acid monolayers for binding of bioactive molecules to titanium surfaces[J].Langmuir，2006，22（19）：8 197－8 204.

[50]KALASKAR D M，ULIJN R V，GOUGH J E，et al.Characterisation of amino acid modified cellulose surfaces using TOF－SIMS and XPS[J].Cellulose，2010，17（4）：747－756.

[51]HA C S，GARDELLA Jr J A.Surface chemistry of biodegradable polymers for drug delivery systems[J].Chemical Reviews，2005，105（11）：4 205－4 232.

[52]CHEN J，LEE J W，HERNANDEZ DE GATICA N L，et al.Time－of－flight secondary ion mass spectrometry studies of hydrolytic degradation kinetics at the surface of poly（glycolic acid）[J].Macromolecules，2000，33（13）：4 726－4 732.

[53]LEE J W，GARDELLA JR J A.Quantitative TOF－SIMS analysis of oligomeric degradation products at the surface of biodegradable poly（αhydroxy acid）s[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2002，13（9）：1 108－1 119.

[54]LEE J W，GARDELLA J A.In vitro hydrolytic surface degradation of poly（glycolic acid）：Role of the surface segregated amorphous region in the induction period of bulk erosion[J].Macromolecules，2001，34（12）：3 928－3 937.

[55]SUN L，GARDELLA JR J A.Oxidation－assisted secondary ion mass spectrometry methodology to quantify mixed alkylthiol self－assembled monolayers on gold：Applications to competitive chemical adsorption[J].Langmuir，2002，18 （24）：9 289－9 295.

[56]MUDDIMAN D C，GUSEV A I，PROCTOR A，et al.Quantitative measurement of cyclosporin A in blood by time－of－flight mass spectrometry[J].Analytical Chemistry，1994，66（14）：2 362－2368.