肺炎鏈球菌的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性快速檢測方法的建立和應(yīng)用

楊錦紅 劉 洋 王新林 李方去 陶洪群 李向陽

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，S.p)在世界范圍內(nèi)仍然是一種重要的病原體，可引起肺炎、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎及菌血癥等多種嚴(yán)重疾?。?，2］。對肺炎鏈球菌的診斷，目前主要依賴傳統(tǒng)方法——培養(yǎng)法進(jìn)行檢測，但是培養(yǎng)法需要對微生物分離、培養(yǎng)和鑒定等檢測存在著耗時長、靈敏度低、操作繁瑣等缺點，對臨床快速診斷，尤其是侵襲性感染的診斷不及時，造成臨床治療上的延誤。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，肺炎鏈球菌的快速診斷研究進(jìn)展迅速，其中有環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)、PCR檢測核糖體(16SrRNA)、BOX－PCR、熒光定量PCR、免疫層析法、DNA探針雜交等，從基因/基因組的層面對肺炎鏈球菌進(jìn)行快速診斷［3，4］。

材料與方法

1.菌株來源:2010年3～6月在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院住院患兒送檢的呼吸道、血液及腦脊液標(biāo)本分離的非重復(fù)的20株肺炎鏈球菌。質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。

2.儀器:Microscan Walkaway－90SI型全自動細(xì)菌鑒定儀(德國西門子公司)、PCR儀(德國Eppendorf公司產(chǎn)品)、電泳儀(美國BIO.RAD公司)、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一公司)

3.試劑:PCR試劑和DNA MarkerⅠ購于TaKaRa大連寶生物公司，引物參照文獻(xiàn)設(shè)計［5］，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、MseⅠ購自Fermentas公司，DNA分子質(zhì)量對照購自MBI公司。EcoRⅠ接頭、MseⅠ接頭、引物序列見表1。

4.菌種鑒定及藥敏試驗:挑選血平板上臍窩狀的可疑菌落分純，同時做奧普托欣(Optochin)試驗，再用 Microscan Walkaway－90SI型全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定及藥敏試驗，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI(2010版)標(biāo)準(zhǔn)。

5.AFLP實驗:根據(jù)張順等［6］報道的方法改進(jìn)后用于實驗。(1)基因組DNA的制備:細(xì)菌DNA的制備:挑3～5個菌落調(diào)制成0.5麥?zhǔn)宵c菌液，采取一系列稀釋梯度，配制成濃度依次為1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml的菌液，收集細(xì)菌采用CTAB法提取肺炎鏈球菌染色體DNA即為擴(kuò)增檢測的模板液，用1%瓊脂糖電泳檢測基因組DNA，并用紫外分光光度計定量。(2)基因組DNA的雙酶切:取基因組DNA各2μl，內(nèi)切酶EcoRⅠ5U、MseⅠ5U，10×Buffer 4μl，補(bǔ)水至40μl，先在37℃水浴5h，然后轉(zhuǎn)入65℃水浴2h，用1%瓊脂糖電泳檢測酶切產(chǎn)物。(3)接頭的連接反應(yīng):取酶切產(chǎn)物20μl，EcoR I Adapter、Mse I Adapter各1μl，T 4 DNA連接酶0.5μl，10× Buffer 3μl，補(bǔ)水至30μl，22℃，連接過夜。(4)PCR擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系體積為25μl，上下游引物(20μmol/L)各0.5μl，dNTP(100mmol/L)2μl，模板 DNA 3μl，MgCl2(25mmol/L) 1.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，EX Taq酶(5U/μl)0.125μl，ddH2O 14.375μl，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性4min，然后94℃15s→65℃30s→72℃15s共40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。(5)電泳分析:將產(chǎn)物放在6%的瓊脂凝膠中，150V電泳20min后用凝膠成像儀觀察DNA條帶的分布，產(chǎn)物片段多在100～600bp之間呈現(xiàn)出梯狀分布，特征性條帶明顯，具有較強(qiáng)的辨識度。

結(jié)果

1.特異度試驗:檢測20株肺炎鏈球菌，結(jié)果均陽性(圖1)。15株非肺炎鏈球菌均陰性，金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌、宋內(nèi)志賀菌、傷寒沙門菌、粘質(zhì)沙雷菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌及銅綠假單胞菌等多種細(xì)菌均為陰性，見圖2。表明AFLP－PCR具有良好的特異性。

圖1 20株肺炎鏈球菌AFLP圖譜1～19.肺炎鏈球菌臨床分離株;20.肺炎鏈球菌ATCC49619，M.Marker

圖2 特異性試驗AFLP結(jié)果

2.靈敏度試驗:經(jīng)活菌平板計數(shù)，檢測細(xì)菌原液濃度為1.5×108CFU/ml，分別進(jìn)行稀釋成為1.5× 108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5× 103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml，AFLP－PCR方法可檢測到第6個稀釋度，最低檢測濃度為1.5× 103CFU/ml，見圖3。

圖3 敏感性AFLP－PCR結(jié)果

討論

傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)分離生化鑒定方法作為細(xì)菌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測肺炎鏈球菌，從微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定到生化分析，做出確診整個過程約需2～3天;而對于肺炎鏈球菌所致感染，尤其是侵襲性的深部感染，要求快速、方便的特點，該法不能滿足要求。近年來，以PCR技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)得到不斷發(fā)展。其中，PCR、熒光定量PCR作為快速檢測技術(shù)得到了一定的應(yīng)用。然而這些方法雖然可用于快速檢測，但因靈敏度和特異度上的差別，加上檢測費用較高，在現(xiàn)場使用有一定的局限性。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進(jìn)步，現(xiàn)已建立起來的AFLP－PCR具有高效、快速、簡便的優(yōu)越性，為及時快速檢測提供了新方法。

本研究中選擇了肺炎鏈球菌的特異基因作為靶序列，設(shè)計了兩對引物，對基因組DNA進(jìn)行雙酶切后鏈接，優(yōu)化反應(yīng)條件，選擇適宜的反應(yīng)液配方，建立了AFLP方法檢測肺炎鏈球菌。該方法靈敏度高，最低可檢測到1.5×103CFU/ml，與其他PCR快速診斷檢測水平相當(dāng)［7，8］;特異度高，未出現(xiàn)假陰性和假陽性，本研究所用20株肺炎鏈球菌均能檢測出來，而15株非肺炎鏈球菌，包括金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌等革蘭陽性菌，也包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌，均未檢測出來，表明特異度高，并且電泳圖形具有一定的可識別性。

為了及時準(zhǔn)確地檢測出疑似病例是否為肺炎鏈球菌感染，需要有靈敏特異的檢測方法。提取細(xì)菌DNA進(jìn)行肺炎鏈球菌病原學(xué)的鑒定，尤其是與菌落形態(tài)與其相似的草綠色鏈球菌鑒別，是人們一直在尋找的方法。AFLP簡單、快速、敏感性好、特異性高，本研究AFLP條帶較多，特征性強(qiáng)，分辨率較高，能可靠地檢測出肺炎鏈球菌的同時，還可以分析出親緣關(guān)系，適合肺炎鏈球菌的早期診斷，尤其是無菌體液中的侵襲性感染，有著較大的診斷意義。

1 綦廷娜，王和，陳崢宏.肺炎鏈球菌L型對人淋巴細(xì)胞因子分泌刺激作用［J］.中國公共衛(wèi)生，2010，26(5):610－611

2 Barzilay EJ，Brien KL，Kwok YS，et al.Could a single dose of pneumococcal conjugate vaccine in children be effective?Modeling the optimal age of vaccination［J］.Vaccine，2006，24(7):904－913

3 胡曉彥，桂炳東，王伶，等.BOX－PCR技術(shù)在肺炎鏈球菌的檢測中的應(yīng)用［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2010，28(3):209－211

4 樊慧珍，于化鵬，黃文杰，等.DNA探針雜交快速檢測肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，12(10):1503－1505

5 Kalpoe JS，Templeton KE，Horrevorts AM，et al.Molecular typing of a suspected cluster of nocardia farcinica Infectionsby use of randomly amplified polymorphic DNA，pulsed－field gel electrophoresis，and amplified fragment length polymorphism analyses［J］.Journal of clinicalmicrobiology，2007，45(12):4048－4050

6 張順，蔡挺，陳琳，等.用AFLP分型和分子標(biāo)記研究鮑曼不動桿菌院內(nèi)感染傳播途徑［J］.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2009，21(1):7－9

7 Dijkshoorn L.Typing acinetobacter strains:applications and methods［J］.Acinetobacter Biology and Pathogenesis，2009，1(20):85－88

8 胡農(nóng)，蔡挺，張順，等.耐藥鮑曼不動桿菌擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的建立［J］.浙江大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2007，36 (6):537－542