梓苷的抗腫瘤活性研究

王奇志，管福琴，孫浩，陳雨，趙友誼，馮煦，王鳴

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所南京中山植物園江蘇省藥用植物研究開發(fā)中心，江蘇南京210014)

梓實(shí)系紫葳科Bignoniaceae梓屬CatalpaL.植物梓Catalpa ovataG.Don的果實(shí)［1］，產(chǎn)于湖南、河北、四川、東北等地。梓屬樹皮習(xí)稱梓白皮，果實(shí)稱梓實(shí)，均供藥用，《本草鋼目》記載具有清熱、解毒、致瀉、殺三蟲和利尿的功能。近代藥理研究表明除利尿外尚有抗痙攣、降血糖、抗飽脹感和增強(qiáng)抗癌藥作用的功效［2-6］，梓實(shí)中主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷［7-14］，如梓醇和梓苷(結(jié)構(gòu)見圖1)。本實(shí)驗(yàn)對梓苷的生物活性進(jìn)行了深入研究，現(xiàn)將抗腫瘤的結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由南京青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，合格證:SCXK(蘇)2002-0018。

1.2 腫瘤模型小鼠移植性腫瘤模型，肉瘤180(S180)、肝癌(Heps)均從中國科學(xué)院上海藥物研究所引進(jìn)，江蘇省腫瘤防治研究所傳代保種，人胃癌細(xì)胞由江蘇省腫瘤防治研究所提供，來自胃癌病人手術(shù)標(biāo)本制成的癌細(xì)胞懸液(未鑒定)。

1.3 藥材來源梓實(shí)鮮品20 kg于2010年10月采自南京中山植物園，經(jīng)江蘇省中國科學(xué)院植物研究所袁昌齊研究員鑒定為紫葳科梓屬植物梓Catalpa ovataG.Don的果實(shí)。

圖1 梓苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of catalposide

1.4 藥品及試劑梓苷自行分離，經(jīng)HPLC歸一化法測定純度大于95%，5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(TaX)、甲氨蝶呤(MTX)、盤尼西林(HePT)、鬼臼乙叉苷(VP16)均由江蘇省腫瘤防治研究所提供。

1.5 儀器設(shè)備超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司YJ875)，電子分析天平(賽多利斯公司)，恒溫水浴鍋(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DK-8A型)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備梓實(shí)干品5 kg，80%乙醇熱提3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮成0.75 kg浸膏，加水500 mL懸浮，分別用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得正丁醇部位120 g，經(jīng)大孔樹脂(D101)吸附，乙醇-水梯度洗脫，收集30%乙醇洗脫部分，通過硅膠柱色譜［三氯甲烷-甲醇梯度洗脫，收集三氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脫部分］、再經(jīng)Sephadex LH-20柱(甲醇洗脫)重結(jié)晶得梓苷純品(15 g)。

白色針晶(甲醇)，mp 145～146℃，［α23D］-184(c 1.0，MeOH)，易溶于甲醇、乙酸乙酯和DMSO，可溶于水。TLC上噴5%H2SO4-EtOH液顯灰褐色斑點(diǎn)。UVλMeOHmax(nm):260(4.27)，303(1.37)。API-ESI(+)MS:505［M+Na］+(100)。IRνKBrmax(cm－1):3 409，2 928，2 891，1 698，1 653，1 607，1 590，1 515，1 452，1 356，1 279，1 169，1 065，968，928，860，770，701，639，508，413。ESI(+)MS(m/z):505［M+Na］+(100)。1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:2.59(1H，m，H-5)，2.69(1H，m，H-9)，3.34-3.45(4H，m，H-2'～5')，3.52(1H，d，J=13.2 Hz，H-6'a)，3.73(1H，m，H-7)，3.76(1H，d，J=12.8 Hz，H-10a)，3.87(1H，d，J=13.2 Hz，H-6'b)，4.05(1H，d，J=12.8 Hz，H-10b)，4.83(1H，d，J=7.8 Hz，H-1')，4.98(1H，dd，J=5.8，5.9 Hz，H-4)，5.07(1H，d，J=5.8 Hz，H-1)，5.09(1H，dd，J=7.8，4.4 Hz，H-6)，6.33(1H，d，J=5.9 Hz，H-3)，6.86(2H，dd，J=8.8，2.9 Hz，H-3″和H-5″)，7.89(2H，dd，J=8.5，2.9 Hz，H-2″和H-6″)，10.43(1H，s，4″-OH，加D2O消失)。13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ:93.6(C-1)，140.7(C-3)，101.7(C-4)，34.8(C-5)，79.4(C-6)，58.6(C-7)，65.3(C-8)，41.6(C-9)，60.4(C-10)，98.2(C-1')，73.0(C-2')，76.3(C-3')，70.0(C-4')，76.2(C-5')，61.5(C-6')，120.0(C-1”)，131.5(C-2″和C-6″)，115.0(C-3″和C-5″)，161.9(C-4″)，165.9(CO)。與文獻(xiàn)［4-7］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。

2.2 體內(nèi)抗腫瘤作用按《抗癌藥物藥效學(xué)研究指導(dǎo)原則》方法進(jìn)行。選擇腫瘤生長良好且無潰破的腫瘤小鼠，在無菌條件下取出腫瘤，用0.9%NaCl按1∶4稀釋(1×108個(gè)/mL)制成瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠于前肢腋窩皮下接種0.2 mL，接種后隨機(jī)分組，每組雌雄各半。次日開始給藥，每日1次，連續(xù)8 d，第9天稱體質(zhì)量、解剖、剝離瘤塊，取出脾臟、胸腺，分別稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

2.3 體外殺傷作用癌癥病人手術(shù)標(biāo)本，制成癌細(xì)胞懸液，每日加藥一次，連續(xù)5 d，采用MTT法測定每孔OD值。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 梓苷對小鼠移植性腫瘤的抑瘤作用當(dāng)劑量為25 mg/kg時(shí)，對S180的抑制率為60.68%，超過了陽性對照5-FU(55.56%);對Heps抑制率為50.80%。結(jié)果說明梓苷對小鼠移植性腫瘤S180、Heps有明顯的抑制作用和極顯著性差異(P＜0.001)，見表1，其中對S180的抑制作用大于對Heps的。

表1 梓苷對小鼠移植性腫瘤的抑制作用(n=10)Tab.1 Inhibition of catalposide on transplanted tumor in m ice(n=10)

3.2 梓苷對免疫器官質(zhì)量的影響梓苷對荷瘤(S180)、(Heps)小鼠免疫器官質(zhì)量都有一定的提高，與空白比較無顯著性差異，而陽性對照藥5-FU則有所降低，說明梓苷在發(fā)揮抗癌作用的同時(shí)不抑制免疫功能，效果比5-FU好。見表2、3。

表2 梓苷對荷瘤(S180)小鼠免疫器官質(zhì)量的影響(n=10)Tab.2 Effects of catalposide on immune organs weight of S180-bearing m ice(n=10)

表3 梓苷對荷瘤(Heps)小鼠免疫器官質(zhì)量的影響(n=10)Tab.3 Effects of catalposide on immune organs weight of Heps-bearing m ice(n=10)

4 討論

梓苷是梓實(shí)的主要活性成分之一，約含2%，傳統(tǒng)臨床應(yīng)用梓實(shí)利尿，治療糖尿病。本實(shí)驗(yàn)首次對梓苷的抗腫瘤活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)梓苷對小鼠移植性腫瘤肉瘤(S180)和肝癌(Heps)均有明顯的抑制作用。當(dāng)梓苷劑量為25 mg/(kg·d)灌胃給藥時(shí)其抑制率分別為60.68%和50.80%，高于或相當(dāng)于陽性藥5-Fu的抑制率。研究結(jié)果表明梓苷在動(dòng)物體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)無明顯影響，說明梓苷在發(fā)揮抗癌作用的同時(shí)，不抑制免疫功能。

利用江蘇省腫瘤防治研究所的實(shí)驗(yàn)條件，通過對人源性胃癌靶細(xì)胞體外的直接殺傷作用實(shí)驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)梓苷對人癌細(xì)胞的體外殺傷作用不明顯(表4)，說明梓苷對癌細(xì)胞生長的抑制作用不是直接的殺傷作用，其抗癌的作用機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

表4 梓苷對人癌細(xì)胞的體外殺傷作用(n=3)Tab.4 Killing for human cancer cells in vitro of catalposide(n=3)

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