多指標(biāo)綜合優(yōu)化疏乳消塊方的提取工藝

劉蘭萍，段好剛，魏玉輝，李波霞，秦紅巖，武新安

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州730000)

疏乳消塊方劑由柴胡、當(dāng)歸、香附、元胡等中藥組成，具有疏肝解郁、軟堅(jiān)散結(jié)之功效，用于治療乳腺增生、乳痛等癥［1］。該制劑是蘭州大學(xué)第一醫(yī)院協(xié)定處方，臨床應(yīng)用40多年已取得了較好的臨床療效。前期實(shí)驗(yàn)表明，疏乳消塊方的藥效部位主要是水提物部分。為了對(duì)其進(jìn)行新制劑研發(fā)，本實(shí)驗(yàn)以干膏得率、阿魏酸含有量、正丁醇萃取物含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)法對(duì)疏乳消塊方最佳水提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT二元梯度泵，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，DGU-20A在線脫氣系統(tǒng)，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，CTO-20A柱溫箱，LC solution色譜工作站(島津，日本)，ARA520電子分析天平(美國(guó)，Ohaus公司)。

阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110773-200611)，甲醇為色譜純(美國(guó)，Dikam公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。去離子水(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院自制)。當(dāng)歸，柴胡，元胡等十一味藥材均購(gòu)自甘肅天森天水中藥飲片廠，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室專家鑒定，均為2010年《中國(guó)藥典》收載品種。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，確定疏乳消塊處方的藥效部位為水溶性部分，因此設(shè)計(jì)提取溶媒為水。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)有關(guān)資料及初步預(yù)試結(jié)果，確定加水總倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)為主要影響因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。鑒于加水總倍量較多，為了便于大工業(yè)生產(chǎn)濃縮，根據(jù)處方藥材的吸水量及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同提取次數(shù)加入的溶媒的倍量進(jìn)行了重新分配，具體分配方法見(jiàn)表2。

表1 因素-水平Tab.1 Levels of orthogonal factor

表2 水煎分次提取溶媒分配Tab.2 Distribution list of dissolvant

2.2 提取方法按比例稱取處方藥材(除鱉甲外)50 g，共稱取9份樣品，置于回流提取裝置中，按照正交表安排進(jìn)行提取操作，趁熱過(guò)濾(100目篩)，合并提取液，減壓濃縮至約90 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水定容至刻度，作為供試品母液。

2.3 水提物收膏率的測(cè)定［2］精密量取上述供試品母液25 mL，置干燥恒定質(zhì)量的的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，取出至干燥器中冷卻30 min、迅速精密稱定，計(jì)算水提取物收率。

2.4 阿魏酸測(cè)定

2.4.1 色譜條件色譜柱:C18ODS柱(5 μm，4.6 mm×150 mm，大連依利特);流動(dòng)相:甲醇-1%醋酸(30∶70);檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm;體積流量為1.0 mL/min。在上述色譜條件下，阿魏酸色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 阿魏酸對(duì)照品(A)、陰性對(duì)照樣品(B)和水提液樣品(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard reference of ferulaic acid(A)，negative samp le(B)and samp le of water-extraction(C)

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取阿魏酸對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成500 μg/mL的對(duì)照品貯備液。將該貯備液進(jìn)一步稀釋成質(zhì)量濃度為0.98～250 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析，記錄峰面積，以阿魏酸的質(zhì)量濃度為X軸，峰面積為Y軸進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=52 932X－34 360，r2=0.999 6，表明阿魏酸在0.98～250 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗(yàn)分別配制高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度(200、31.25、1.96 μg/m L)的對(duì)照品溶液，分別于日內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定5次，連續(xù)5日內(nèi)進(jìn)樣5次，計(jì)算含量，其日內(nèi)、日間RSD分別小于0.36%和0.78%，表明方法的精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)精密量取2.2項(xiàng)下的供試品液6份，按上述色譜條件測(cè)定阿魏酸峰面積，計(jì)算阿魏酸的量，6份樣品測(cè)定的RSD均小于1.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取2.2項(xiàng)下的供試品液在0、2、4、6、8 h分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD為2.2%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 樣品測(cè)定精密吸取上述提取供試品液0.5 mL，加甲醇0.5 mL，渦旋混勻1 min后，10 000 r/min離心5 min，上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜后，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算阿魏酸的量。

2.5 正丁醇萃取物含有量的測(cè)定精密量取上述供試品液20 mL，加水飽和的正丁醇20 mL振搖提取，靜置使分層，分取正丁醇層，置干燥恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，取出至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定，計(jì)算正丁醇萃取物收率。

3 結(jié)果

3.1 水提得膏率正交分析計(jì)算水提得膏率結(jié)果后，正交分析結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 水提取工藝L9(34)正交分析Tab.3 Results of L9(34)orthogonal experiments

表4 水提收膏率方差分析結(jié)果Tab.4 ANOVA results of the extraction yield w ith water

由表3極差分析可知，各因素對(duì)水提得膏率的影響大小順序?yàn)镃＞B＞A，直觀分析得提取最佳工藝為A3B3C3。由表4方差分析結(jié)果可知，B因素(提取時(shí)間)及C因素(提取次數(shù))對(duì)得膏率有顯著性影響(P＜0.05)，故選B3C3，而A因素(加水總倍量)對(duì)得膏率無(wú)顯著性影響，故可任選，根據(jù)直觀分析，A3＞A2＞A1，最佳工藝為A3B3C3，即水煎提取3次，加水量分別為7倍、6倍、3倍，每次提取2 h。

3.2 阿魏酸含有量正交結(jié)果分析阿魏酸含有量正交結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。由表3可以看出，各因素對(duì)阿魏酸含有量的影響大小順序?yàn)镃＞B＞A，直觀分析得提取最佳工藝為A2B3C3，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取2 h。由表5方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)阿魏酸的量均無(wú)顯著性影響。

表5 阿魏酸含有量方差分析結(jié)果Tab.5 ANOVA results of the content of ferulaic acid

3.3 正丁醇萃取物含量正交結(jié)果分析正丁醇萃取物收率正交分析結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。由表3可知，各因素對(duì)正丁醇提取物收率的影響大小順序?yàn)锳＞C＞B，直觀分析得最佳提取工藝為A2B2C3。由方差分析結(jié)果可知，A因素和C因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響(P＜0.05)，B因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響，故可任意選擇，根據(jù)直觀分析，C3＞C1＞C2，故選擇C3，最佳工藝為A2B2C3，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取1.5 h。

表6 正丁醇萃取物含有量方差分析結(jié)果Tab.6 ANOVA results of the content of n-butanol extraction

3.4 綜合分析方差分析結(jié)果顯示，在所選指標(biāo)與因素中，因素B及因素C對(duì)水溶性成分的提取效果有顯著性影響，因素A無(wú)顯著性影響。由于阿魏酸及正丁醇萃取物均為極性較大的成分，且水溶性相對(duì)較好，較易提出，綜合直觀分析結(jié)果，因素B及因素C對(duì)水溶性成分的提取效果有一定的影響，結(jié)合提取效率與提取成本，最終優(yōu)選的最佳工藝為A2B3C3，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取2 h。

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)按比例稱取十一味處方藥材(除鱉甲外)50 g，共6份樣品，按照正交試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選確定的最佳工藝提取，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取2 h，合并濾液，濃縮定容至100 mL，取樣依法測(cè)定浸膏出膏率、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及正丁醇萃取物收率，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of verification test

4 討論

疏乳消塊方全方由十二味藥材組成，其鱉甲主要化學(xué)成分為氨基酸、動(dòng)物膠、角蛋白、碘質(zhì)、維生素D等［3］，采用煎煮法提取有效成分不易提出，且容易發(fā)生變化，因此只對(duì)其中十一味藥材進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)選提取方法。柴胡與當(dāng)歸為方中主藥，故選取阿魏酸及正丁醇萃取成分作為指標(biāo)性成分研究疏乳消塊方的最佳提取工藝。

在考察溶媒總倍量時(shí)，一般的正交試驗(yàn)在多次提取時(shí)，多采用加入一定倍量的溶媒提取多次，會(huì)造成提取液的總量過(guò)大，在大工業(yè)生產(chǎn)時(shí)給濃縮步驟帶來(lái)不便。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)處方藥材吸水量情況及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合提取效率，在多次提取時(shí)，對(duì)溶媒總倍量進(jìn)行了重新分配，結(jié)果顯示溶媒總倍量重新分配后的提取方法在對(duì)一些指標(biāo)性成分的提取效果上沒(méi)有明顯差異，且減少了提取液的總量，有助于減少濃縮時(shí)間，更符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。

多指標(biāo)優(yōu)選中藥復(fù)方工藝是提高中藥制劑質(zhì)量的重要手段，符合中藥復(fù)方中多組分，多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，能更合理的評(píng)價(jià)整個(gè)工藝過(guò)程，已被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的工藝研究［4-8］。目前，中藥提取工藝綜合評(píng)價(jià)中常用的經(jīng)驗(yàn)性權(quán)數(shù)法，它是由專家或主研者根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要性來(lái)確定權(quán)重系數(shù)，主觀因素影響較大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)各指標(biāo)結(jié)果單獨(dú)進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果并結(jié)合提取效率及提取成本，最終確定最佳提取工藝，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝各指標(biāo)性成分的含量較高，工藝合理，可行。

［1］何華，張玉春，焦凱.HPLC測(cè)定疏乳消塊丸中阿魏酸的含量［J］.中成藥，2005，27(8):983-984.

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