β-環(huán)糊精包合桂枝、當(dāng)歸混合揮發(fā)油的工藝研究

杜帆，夏新華，趙碧清，蘭星，朱青

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208)

桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的嫩枝，性溫，味甘、辛，具有發(fā)汗解表、溫經(jīng)通陽的功效［1］，含揮發(fā)油類成分，其主要成分為桂皮醛、桂皮酸、桂皮醇、香豆素及原兒茶酸等。藥理研究表明，桂皮酸具有抗菌、消炎作用，桂皮醛有明顯的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用［2］。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥塊根，具有活血補(bǔ)血、補(bǔ)氣調(diào)經(jīng)等功效［3］，含揮發(fā)油達(dá)0.42%，油中含藁苯內(nèi)酯約47%、正丁烯基苯酞11.3%［4］。β-環(huán)糊精是由7個葡萄糖分子以1，4-糖苷鍵連接而成，具有筒狀結(jié)構(gòu)，在中藥制劑中常用于揮發(fā)油的包合，以增加其穩(wěn)定性，或使其粉末化便于制成適宜的劑型［5］。目前已有桂枝揮發(fā)油與當(dāng)歸揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合工藝研究報道［2-3］，但尚未見有關(guān)于桂枝、當(dāng)歸混合揮發(fā)油包合工藝的研究報道。作者在對一種用于股骨頭壞死的臨床經(jīng)驗(yàn)方進(jìn)行制劑工藝研究中，采用蒸餾法提取處方中桂枝、當(dāng)歸混合揮發(fā)油，為減少揮發(fā)油類成分在該制劑生產(chǎn)與貯藏過程中的損失，增加制劑的穩(wěn)定性，保證制劑的療效，確定用β-環(huán)糊精對桂枝與當(dāng)歸所提混合揮發(fā)油進(jìn)行包合。本實(shí)驗(yàn)對桂枝、當(dāng)歸混合揮發(fā)油的包合方法、包合工藝條件及包合物進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期獲得其最佳的包合工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器DF—101S集熱式溫?zé)峒訜岽帕嚢杵?鞏義市英嶼予華儀器廠);98—1—B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);DZF—6050型真空干燥箱(上海驚宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);SHZ—D型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司);RE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。1.2試藥藥材均購自湖南省醫(yī)藥銷售公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的嫩枝;當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。β-環(huán)糊精(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的制備稱取一定量的桂枝、當(dāng)歸飲片，加8倍水浸泡0.5 h，按《中國藥典》2010年版一部附錄揮發(fā)油測定法提取［6］，用乙醚萃取提取液兩次，加無水硫酸鈉脫水［7］，室溫下?lián)]干乙醚，得淡黃色的揮發(fā)油，密閉保存，備用。

2.2 揮發(fā)油包合工藝的研究

2.2.1 包合方法的選擇目前應(yīng)用較多的包合方法是飽和水溶液法和研磨法［8］，故采用這兩種方法對桂枝與當(dāng)歸所提混合揮發(fā)油進(jìn)行包合并加以比較。

2.2.1.1 包合物的制備［9-10］

飽和水溶液法:取β-環(huán)糊精6 g，置于錐形瓶中，加蒸餾水150 mL，加熱溶解，冷卻至50℃并于磁力攪拌器上恒溫，加入1 mL揮發(fā)油(預(yù)先配成50%的無水乙醇溶液)，恒溫攪拌3 h，冷卻至室溫，放入冰箱冷藏24 h，抽濾，包合物用石油醚沖洗3次(每次10 mL)，50℃真空干燥4 h，稱質(zhì)量，備用。

研磨法:取β-環(huán)糊精6 g，置于研缽中，加3倍量水，研磨均勻。量取揮發(fā)油1 mL(預(yù)先配成50%的無水乙醇溶液)，緩緩加入研缽中，連續(xù)研磨3 h至成糊狀，抽濾，包合物再用石油醚沖洗3次(每次10 mL)，50℃真空干燥4 h，稱質(zhì)量，備用。

2.2.1.2 包合物收率及揮發(fā)油包合率的測定取收集的干燥包合物，精密稱質(zhì)量，置于揮發(fā)油提取器中，按《中國藥典》2010年版附錄XD揮發(fā)油測定法甲法測定其揮發(fā)油含有量，按下列公式計算包合物收得率及揮發(fā)油包合率［11］。另精密量取混合揮發(fā)油1.00 mL，同法進(jìn)行測定，計算空白回收率(本實(shí)驗(yàn)測得回收率為80%)。結(jié)果表明，飽和水溶液法的揮發(fā)油包合率明顯高于研磨法(見表1)。

包合物收得率(%)=［包合物質(zhì)量/(β-環(huán)糊精投入量+揮發(fā)油投入量)］×100%

揮發(fā)油包合率(%)=［包合物實(shí)際收油量/(揮發(fā)油的投入量×空白回收率)］×100%

空白回收率(%)=(實(shí)際收油量/投入揮發(fā)油量)×100%

表1 兩種包合方法的比較(n=3)

2.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選包合工藝條件

2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計采用正交試驗(yàn)法對飽和水溶液法包合工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。選擇揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比、包合溫度、攪拌時間作為考察因素，以揮發(fā)油包合率作為評價指標(biāo)，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)。所選因素水平及正交試驗(yàn)安排見表2、表3。

表2 因素水平

2.2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果依正交試驗(yàn)表(表3)安排的工藝條件，取揮發(fā)油與β-環(huán)糊精參照上述飽和水溶液法分別制備桂枝與當(dāng)歸混合揮發(fā)油的包合物，收集包合物，測定其揮發(fā)油包合率，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。由直觀分析可知，各因素作用的主次為A＞C＞B，最佳工藝條件為A2B1C2(見表3)。方差分析表明，A、C二因素對揮發(fā)油的包合有顯著性影響，B因素的影響不顯著(見表4)。因此，可確定最佳包合工藝條件為A2B1C2。

表3 包合工藝正交試驗(yàn)及結(jié)果

表4 方差分析

2.2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)為驗(yàn)證方案A2B1C2的合理性，按照方案A2B1C2的包合工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次，其揮發(fā)油包合率分別為84.9%、85.1%、85.7%，表明所確定的最佳包合工藝條件A2B1C2合理可行。

2.3 包合物的TLC驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 供試品溶液與對照品溶液的制備取當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油適量，按照上述最佳包合工藝條件制備包合物。取包合物1 g，共2份，一份加乙酸乙酯5 mL，冷浸1 h，取上清液作為包合物供試品溶液Ⅰ;另一份加蒸餾水20 mL，再加乙酸乙酯5 mL，超聲處理30 min，取上層液，加無水硫酸鈉脫水，濾過，取續(xù)濾液作為包合物供試品溶液Ⅱ。取β-環(huán)糊精1 g，按供試品溶液Ⅱ的方法制備陰性對照品溶液。取當(dāng)歸揮發(fā)油0.5 mL，置于5 mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為當(dāng)歸揮發(fā)油對照品溶液。另取桂皮醛對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為桂皮醛對照品溶液。

2.3.2 包合物中當(dāng)歸揮發(fā)油的薄層分析分別吸取當(dāng)歸揮發(fā)油對照品溶液2 μL與包合物供試品溶液(Ⅰ、Ⅱ)、陰性對照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置于365 nm紫外光燈下檢視［6］。結(jié)果顯示，供試品溶液Ⅱ在與對照品色譜相應(yīng)的位置具有相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，而供試品溶液Ⅰ與陰性對照品溶液色譜中均未見任何斑點(diǎn)(見圖1)，表明當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)入了β-環(huán)糊精分子內(nèi)部形成了包合物。

圖1 當(dāng)歸揮發(fā)油TLC圖譜

2.3.3 包合物中桂枝揮發(fā)油的薄層分析分別吸取桂皮醛對照品溶液2 μL與包合物供試品溶液(Ⅰ、Ⅱ)、陰性對照品溶液各15 μL，點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇溶液顯色［12］。結(jié)果顯示，供試品溶液Ⅱ在與對照品色譜相應(yīng)的位置具有相同的顏色的斑點(diǎn)，而供試品溶液Ⅰ與陰性對照品溶液色譜中均未見任何斑點(diǎn)(見圖2)，表明桂枝揮發(fā)油進(jìn)入了β－環(huán)糊精分子內(nèi)部形成了包合物。

圖2 桂枝揮發(fā)油TLC圖譜

3 討論

采用β-環(huán)糊精對當(dāng)歸、桂枝混合揮發(fā)油進(jìn)行包合，有利于提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性，并可使其由液體變?yōu)楣腆w粉末而便于制成固體制劑。本實(shí)驗(yàn)比較了兩種包合方法對當(dāng)歸、桂枝混合揮發(fā)油的包合效果，結(jié)果顯示飽和水溶液法優(yōu)于研磨法。在此研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)對飽和水溶液法的包合工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳包合工藝條件為揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比為1∶8、包合溫度為40℃、攪拌時間為3 h。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可為當(dāng)歸、桂枝相應(yīng)制劑的生產(chǎn)工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

采用TLC法驗(yàn)證當(dāng)歸、桂枝混合揮發(fā)油包合物過程中，包合物供試品溶液Ⅰ系以乙酸乙酯冷浸包合物制備而成，由于包合物在乙酸乙酯中不溶，包合到β-環(huán)糊精分子內(nèi)部的揮發(fā)油成分不能從包合物中溶出，故其TLC色譜中未檢出當(dāng)歸與桂枝揮發(fā)油成分，同時也表明包合物的表面沒有吸附揮發(fā)油。包合物供試品溶液Ⅱ系在包合物中同時加水和乙酸乙酯經(jīng)超聲處理制備而成，由于包合物在水中有一定的溶解性，借助超聲波的作用可使揮發(fā)油成分從溶解的包合物中釋放出來，同時被親油性較好的乙酸乙酯所萃取，故可從乙酸乙酯萃取液(即供試品溶液Ⅱ)的TLC色譜中檢出當(dāng)歸與桂枝揮發(fā)油成分。另外，以β-環(huán)糊精制成的陰性對照無干擾。因此，通過上述TLC法，可以確認(rèn)當(dāng)歸、桂枝混合揮發(fā)油與β-環(huán)糊精形成了包合物。

［1］徐世軍，沈映君，解宇環(huán).桂枝揮發(fā)油的抗炎作用研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(3):186-189.

［2］徐媛，戚志華，王慶偉，等.桂枝揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29(11):1474-1476.

［3］李元波，侯世祥.當(dāng)歸揮發(fā)油的包合工藝［J］.中國中藥雜志，2007，32(11):1100-1103.

［4］張貴君.中藥鑒定學(xué)［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，2009:119.

［5］張兆旺.中藥藥劑學(xué)［M］.2版.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2007:417.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄63，124.

［7］李成艦，夏新華，彭買姣.β-環(huán)糊精包合白術(shù)、肉豆蔻揮發(fā)油的工藝研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，27(4):21-22.

［8］趙海霞，陳浩，田景振.環(huán)糊精包合技術(shù)［J］.山東中醫(yī)雜志，2000，19(4):241-243.

［9］顏紅，夏新華，陳鎮(zhèn).β-環(huán)糊精包合佛手、香附、木香混合揮發(fā)油的制備工藝研究［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2005，11(3):59-61.

［10］嚴(yán)建業(yè)，夏新華.β-環(huán)糊精包合荊芥、陳皮揮發(fā)油的工藝研究［J］.中成藥，2003，25(8):612-164.

［11］李元波，殷輝安，周琳，等.當(dāng)歸揮發(fā)油的提取與β－環(huán)糊精包合工藝研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(5):836-840.

［12］高玉瓊，趙德剛，劉建華，等.古威活絡(luò)酊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中成藥，2005，27(2):221-223.