星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒處方

盛歡歡，鄒小廣，楊濤，李巖，程雪梅，王崢濤，王長虹*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所;中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室;中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室;上海市復(fù)方中藥重點實驗室，上海201210;2.新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆喀什844000;3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，新疆烏魯木齊830054)

星點設(shè)計(Central composite design，CCD)是近年來常用的試驗設(shè)計方法［1-3］，可以解決均勻設(shè)計和正交試驗設(shè)計的不足，既較好地保證了試驗精度，又可以分析各因素之間的相互作用，同時試驗次數(shù)也較少。效應(yīng)面優(yōu)化法(Response surface methodology，RSM)是集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體的優(yōu)化方法，通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，依據(jù)該模型可以描繪三維效應(yīng)面圖(或稱因變量面圖)或二維等高線圖，從效應(yīng)面或等高圖上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而回推出自變量取值范圍(即最佳實驗條件)。

穿心蓮總內(nèi)酯(Total lactones from Andrographis paniculata，TLA)是從爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata(burm.f.)Nees中提取的有效成分［4-5］，主要包括穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide，AND)、新穿心蓮內(nèi)酯(Neoandrographolide，NEO)、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯(14-Deoxy-andrographolide，DEO)和脫水穿心蓮內(nèi)酯(Dehydroanddrographolide，DEH)等，具有抗菌、消炎、抗腫瘤等多種藥理活性［6-7］。為了提高其生物利用度，人們對穿心蓮總內(nèi)酯自微乳、自乳化軟膠囊、滴丸、β-環(huán)糊精包合物、脂質(zhì)體等新劑型進行了廣泛的研究［8-13］。如穿心蓮內(nèi)酯自微乳使其生物利用度相對于其片劑提高了1.16倍［8］，脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯脂質(zhì)體使其生物利用度相對于溶液劑提高了1.19倍［13］。但是，微乳、脂質(zhì)體等制劑具有穩(wěn)定性差等缺點。固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是近年發(fā)展的一種新型納米載藥體系，它以天然的或人工合成的固體脂質(zhì)(如飽和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂質(zhì)等)為載體，將藥物吸附或包裹于脂質(zhì)核中制成的納米給藥體系［14-17］。具有控制藥物釋放、提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度、降低藥物的毒副作用等優(yōu)點。因此，本實驗旨在采用星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒(TLA-SLN)處方，為進一步提高其藥物穩(wěn)定性及生物利用度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters 高效液相色譜儀(Empower Pro色譜數(shù)據(jù)工作站，996二極管陣列檢測器，600四元泵，717plus自動進樣器，在線脫氣機，Waters Co.);NS 1001L Panda 2K型高壓勻質(zhì)機(意大利Niro Soavi);EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化公司);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DK—S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);5415R離心機(Eppendorf，德國);BP211D Sartorius電子天平(Sartourius Co.GM);ODS分析色譜柱Kromasil-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);超純水器(Millipore公司);Millipore超濾離心管(Microcon YM-10，MWCO為10 kDa，USA)。

1.2 藥品與試劑穿心蓮內(nèi)酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110797-200307);新穿心蓮內(nèi)酯對照品(上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，純度≥98.5%);14-去氧穿心蓮內(nèi)酯對照品(北京美迪克斯生物技術(shù)有限公司，批號:DXP28001);脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110854-200306);單硬脂酸甘油酯(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司，批號:F20100210);卵磷脂(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:F20100910);山崳酸甘油酯(Compritol 888 ATO，批號:3123PPD);Tween-80(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:F20091214);無水甲醇(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:F20100914);無水乙醇(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:F20101017);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher);穿心蓮總內(nèi)酯提取物(含穿心蓮總內(nèi)酯50%，批號:XC090701西安小草植物科技有限公司);穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒(自制，批號分別為20110105-1，20110105-2，20110105-3)。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒的制備采用冷卻高壓均質(zhì)法(Cold-high pressure homogenization technique)制備穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒。稱取處方量的山崳酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、穿心蓮總內(nèi)酯，在(80±2)℃水浴下溶于適量無水乙醇中，揮除溶劑，迅速移至冰箱(－20℃)中冷凍2 h。取一定量的Tween-80分散于水中，形成均勻的水相，加入上述制得的固體，用高速分散器10 000 r/min分散為均勻的初乳，室溫條件下高壓均質(zhì)機600 bar均質(zhì)7次，冰浴迅速冷卻，即得穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒。

2.2 包封率的測定參考前期建立的穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒包封率和載藥量測定方法［18］，采用HPLC法測定穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒的包封率，對處方組成進行優(yōu)化。

2.3 穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒的處方篩選在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選擇對穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒性質(zhì)影響較顯著的3個因素為考察對象，即藥脂比%(X1)、磷脂脂質(zhì)比(X2)、Tween-80在水中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果及在最高或最低水平時制備穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒的可行性，綜合選擇各因素的水平(見表1)，以穿心蓮內(nèi)酯的包封率(Y1)、新穿心蓮內(nèi)酯的包封率(Y2)、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯的包封率(Y3)和脫水穿心蓮內(nèi)酯的包封率(Y4)的滿意度函數(shù)為評價指標(biāo)(表2)，對試驗結(jié)果進行擬合分析。

當(dāng)指標(biāo)較多時，根據(jù)每個指標(biāo)優(yōu)選的條件可能相互矛盾，對某一效應(yīng)有利的條件可能對其他效應(yīng)不利，各效應(yīng)間需要達成妥協(xié)，使所有指標(biāo)綜合為一個值，該值可反映總體效應(yīng)結(jié)果。數(shù)據(jù)處理辦法為滿意度函數(shù)法［3］，每個指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1間的滿意度函數(shù)(desirability function，DF)，各指標(biāo)滿意度函數(shù)求算幾何平均數(shù)，得總評滿意度函數(shù)。本實驗有4個指標(biāo)，所以DF=(d1d2d3d4)1/4。對取值越小越好的因素和取值越大越好的因素分別進行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求滿意度函數(shù)dmin和dmax。本實驗對4個指標(biāo)成分的包封率進行歸一化處理，包封率要求越大越好，所以使用dmax=(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)。考慮到4個指標(biāo)對總評滿意度函數(shù)的貢獻不同，將每一個指標(biāo)成分的滿意度函數(shù)乘以權(quán)重系數(shù)(按照提取物中4個指標(biāo)成分的量而定，即穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的權(quán)衡系數(shù)分別為0.516 0、0.058 8、0.016 2和0.018 2)，得總評滿意度函數(shù)值見表2。

表1 星點設(shè)計因素與水平Tab.1 Factors and levels for central composite design

表2 星點實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Arrangement and results of central composite design

2.4 模型擬合應(yīng)用Design Expert 7.0軟件，以DF值為因變量對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合分析。

多元線性擬合回歸方程為:Y=8.962 0×10－3+3.690 8×10－3X1－2.642 4×10－3X2+3.347 7×10－3X3，相關(guān)系數(shù)(R)為0.624 5，P＜0.05。

多元二項式擬合方程為:Y=－0.033 8+0.023 7X1－0.034 1X2+4.076 7×10－3X3+1.899 0×10－3X1X2－2.116 1×10－3X1X3+0.015 3X2X3－1.147 4×10－3－0.011 2－8.417 0×10－4，相關(guān)系數(shù)(R)為0.947 8，P＜0.001。

二元非線性方程擬合度較高，最終選擇二元非線性方程擬合，并繪制效應(yīng)面圖(圖1～圖3)。由于三維圖只能表示效應(yīng)對其中二個因素的關(guān)系，通常的處理方式是將另一個因素置為中心值，再描繪效應(yīng)面，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)DF值(范圍0.041～0.053)在圖上選取較佳處方范圍:X1=8.45%～10%，X2=0.82%～1.25%，X3=3.00%～4.16%。綜合評價，得最佳工藝參數(shù)為:X1=10%，X2=1.25%，X3=4%。根據(jù)包封率的特性，設(shè)定各成分包封率的區(qū)域:Y1=74%～90%;Y2＞90%;Y3＞90%;Y4＞90%。然后按此要求重疊各指標(biāo)的二維等高線圖，得到能同時滿足以上條件的最佳區(qū)域見圖4。

由圖1～圖3可看出，三維效應(yīng)圖均為曲面，說明藥脂比(X1)、磷脂脂質(zhì)比(X2)、Tween-80在水中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)和DF值呈非線性關(guān)系。圖1表明隨著X1的增大，DF先逐漸增加，后降低。圖2說明隨著X3增大，DF逐漸增大，X1的增大，DF先增大再降低。圖3隨著X2，X3的增大，DF逐漸增大。X1，X2，X3用量不同對各指標(biāo)成分包封率的總評滿意度函數(shù)的影響不同。

由重疊等高線圖(圖4)可知，白色區(qū)域既是各成分包封率的區(qū)域重疊部位，也是選擇處方的最佳區(qū)域。其進一步縮小了處方的優(yōu)化區(qū)域，大大提高了工作效率。

圖1 藥脂比(X1)和磷脂脂質(zhì)比(X2)對DF值的三維效應(yīng)面圖(A)和二維等高線圖(B)(Tween-80為3%)Fig.1 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X1and X2as entrapment efficiency(with 3%Tween-80)

圖2 藥脂比(X1)和Tween-80在水中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)對DF值的三維效應(yīng)面圖(A)和二維等高線圖(B)(磷脂脂質(zhì)比為1.25∶1)Fig.2 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X1and X3as entrapment efficiency(with lecithin∶lipid=1.25∶1)

圖3 磷脂脂質(zhì)比(X2)和Tween-80在水中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)對DF值的三維效應(yīng)面圖(A)和二維等高線圖(B)(藥脂比為7%)Fig.3 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X2and X3as entrapment efficiency(with drug∶lipid:7%)

圖4 穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒處方優(yōu)化的重疊等高線圖(X3=4%)Fig.4 The overlapping contour map of the optimal TLA-SLN formulation(X3=4%)

2.5 優(yōu)化工藝驗證照上述優(yōu)化處方(穿心蓮總內(nèi)酯50 mg;單硬脂酸甘油酯250 mg;山崳酸甘油酯250 mg;卵磷脂625 mg;4%Tween-80 50 mL)采用冷卻-均質(zhì)法制備3批穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒，測定包封率總評滿意度函數(shù)的預(yù)測值與實際值的相對偏差見表3。由表3可知，偏差的絕對值均小7%，說明實驗所得擬合方程可以很好的預(yù)測各因素和評價指標(biāo)之間的關(guān)系。

表3 優(yōu)化處方評價指標(biāo)的預(yù)測值和實測值(n=3)Tab.3 Comparison of the observed and predicted values of the optimum formulations

按照優(yōu)化處方3批穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒，經(jīng)過分析測定結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的包封率分別為(80.04±0.70)%、(94.94±3.87)%、(92.17±1.61)%、(97.64±0.68)%，載藥量分別為(4.11±0.04)%、(0.56±0.02)%、(0.15±0.00)%、(0.18±0.00)%［16］。平均粒徑為(322.67±2.50)nm，Zeta電位為(－17.98±1.19)mV。

3 討論

選擇適合于非線性擬合的實驗設(shè)計方法，可以提高優(yōu)化效果，減少試驗次數(shù)，預(yù)測性好。星點設(shè)計就是一種較為成熟的方法。根據(jù)其所建立的數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面，直接讀取較佳工藝條件區(qū)域。多個效應(yīng)所選擇的較佳條件通過疊加，可以進一步縮小較佳條件范圍［19］。本實驗采用星點設(shè)計安排實驗，數(shù)據(jù)采用效應(yīng)面法來進行處理，用多元線性方程和二項式方程來對數(shù)據(jù)分別進行擬合，從擬合方程的相系數(shù)R值可見，4個指標(biāo)采用二項式方程擬合效果較好。

本實驗以穿心蓮總內(nèi)酯中的穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯4種已知可定量的成分為研究對象，以其包封率為指標(biāo)優(yōu)化穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒的處方。若將全部的影響因素看成一個整體(單位1)，4個已知成分(穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯)在穿心蓮總內(nèi)酯中占到總量的61%，而其余的39%為未知成分。在計算滿意度函數(shù)時，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的權(quán)衡系數(shù)分別取值為0.516 0、0.058 8、0.016 2和0.018 2，其總和為0.61。當(dāng)將這些可定量測定的指標(biāo)成分作為一個固定的影響系數(shù)的整體來看待時，即相當(dāng)于提取物中其它未知成分(占39%)的影響系數(shù)也隨之確定。依此對穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒的處方進行了優(yōu)化，為其它多指標(biāo)成分的中藥提取物制劑處方優(yōu)化提供了一種有效的實驗設(shè)計方法的參考。

從驗證實驗結(jié)果可以看出，穿心蓮總內(nèi)酯中的4個主要成分穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的包封率分別為(80.04±0.70)%、(94.94±3.87)%、(92.17±1.61)%、(97.64±0.68)%。從4個成分的結(jié)構(gòu)可以看出，新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯與穿心蓮內(nèi)酯相比，均是在穿心蓮內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)中的14位去羥基化后得到的一系列衍生物，而使分子極性發(fā)生了變化。說明不同成分的理化性質(zhì)特別是脂溶性與其包封率差異密切相關(guān)。

將溶解度低、吸收不良、穩(wěn)定性欠佳的藥物進行納米化是提高其生物利用度的途徑之一。本實驗對穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒的處方進行了研究，但其生物利用度如何，還有待于進一步考察和評價。

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