星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化美洲大蠊提取工藝

張臻，宋芹，傅超美*，高飛，徐曉秋，盛菲亞

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西部中藥材開(kāi)發(fā)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137;2.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都610106)

美洲大蠊Periplaneta americana(L.)為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，俗稱(chēng)“蟑螂”，入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂“味咸，寒，治血瘀，癥堅(jiān)，寒熱，破積聚，喉咽痹，內(nèi)寒無(wú)子”［1］?！侗静菥V目》上記載其主治“瘀血，癥堅(jiān)，寒熱，下氣，利血脈”，常用來(lái)治療小兒疳積、疔瘡、喉蛾、無(wú)名腫毒、膨脹、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬傷等疾?。?］。現(xiàn)代研究表明美洲大蠊化學(xué)成分眾多，主要分為兩大類(lèi):向體外釋放的具揮發(fā)性的信息素類(lèi)成分，包括性信息素和聚集信息素;存在于機(jī)體內(nèi)部的氨基酸和蛋白質(zhì)類(lèi)成分［3-5］。其中的氨基酸、蛋白質(zhì)既是美洲大蠊中含有量較高的成分，亦是美洲大蠊藥效學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)以干膏收率、氨基酸提取量、蛋白質(zhì)提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察美洲大蠊的提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材美洲大蠊藥材由四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)西昌美洲大蠊養(yǎng)殖基地提供，為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)美洲大蠊Periplaneta americana(L.)干燥蟲(chóng)體。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器酶標(biāo)儀(美國(guó)thermo公司);Mili-Q超純水處理儀(美國(guó)密理博公司);UV1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);恒溫干燥箱(上海森杏實(shí)驗(yàn)有限公司，DGG-9240);電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司，DZKW-4);電子天平;電磁爐;96孔酶標(biāo)板(NUNC MaxiSorp);蒸發(fā)皿。

1.2.2 試劑谷氨酸對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào):G-025-110305);茚三酮(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào):110518);100T/96樣考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20110719);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫均為分析純。

2 方法與結(jié)果分析

2.1 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)［7-9］和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，影響美洲大蠊提取效果的主要因素是溶媒含乙醇量、提取時(shí)間和溶媒用量，因此，本試驗(yàn)以干膏收率、氨基酸提取量、蛋白質(zhì)提取量為指標(biāo)設(shè)計(jì)水平范圍，見(jiàn)表1。

表1 影響因素與水平

2.2 提取試驗(yàn)方法取美洲大蠊藥材25 g，精密稱(chēng)定，按星點(diǎn)設(shè)計(jì)(表1)回流提取兩次，合并濾液，定容至500 mL，即得提取液，測(cè)其干膏收率、氨基酸提取量、蛋白質(zhì)提取量。

2.3 干膏的測(cè)定取250 mL提取液置于已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘?jiān)?05℃烘箱干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱(chēng)定質(zhì)量。由殘?jiān)|(zhì)量與相應(yīng)藥材質(zhì)量計(jì)算干膏收率。

2.4 氨基酸的測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備取谷氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于10mL量瓶中，加蒸餾水配制成1 mg/mL的對(duì)照品母液［10-11］。

2.4.2 供試品溶液的制備量取0.15 mL提取液置于25 mL量瓶中，依次加入pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%的茚三酮溶液［10］1.0 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加超純水定容至25 mL，即得。

2.4.3 方法學(xué)考察

2.4.3.1 線性關(guān)系考察取谷氨酸對(duì)照品母液，稀釋10倍作為工作溶液，再取工作溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一組25 mL量瓶中，各加磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%茚三酮溶液1.0 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加超純水定容至25 mL，放置10 min后，以吸光度對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到一元線性方程:Y=35.15X－0.124 6，r2=0.999，在0.005～0.025 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.3.2 精密度試驗(yàn)精密量取谷氨酸對(duì)照品工作溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL各3份于一組25 mL量瓶中，按2.4.2項(xiàng)下方法處理工作溶液，測(cè)定吸光度，平行試驗(yàn)3份，RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.4.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)［12］分別精密量取谷氨酸對(duì)照品工作溶液3.0 mL置于量瓶中，按2.4.2項(xiàng)下方法處理工作溶液，分別于0.5、1.0、1.5、2 h測(cè)定吸光度，RSD值為2%，表明該方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)平行制備6份樣品溶液，按以下公式［7］測(cè)定樣品總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù):(W—氨基酸總量，%;C—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的谷氨酸量，mg;L1—測(cè)定用試樣量，mL;L2—試液總量，mL;M—試樣質(zhì)量，g;m—試樣干物率，%)。計(jì)算美洲大蠊總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.35 mg/g，RSD值為2.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3.5 加樣回收率試驗(yàn)取已知量的美洲大蠊藥材1 g，精密稱(chēng)定6份，分別精密加入對(duì)照品適量，按2.4.2項(xiàng)下方法制備，測(cè)定并計(jì)算其平均回收率為99.36%，RSD值為1.52%。

2.4.4 氨基酸的測(cè)定取對(duì)照品或供試品置于25 mL量瓶中，加入pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%的茚三酮溶液1.0 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加超純水定容。以相應(yīng)試劑為空白，參照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在570 nm處測(cè)定吸光度。

2.5 蛋白質(zhì)測(cè)定方法以2.2項(xiàng)下所得提取液為樣品母液，按考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)項(xiàng)下操作，分別配制空白液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、樣品測(cè)定液。精密吸取每類(lèi)溶液3份于3個(gè)酶標(biāo)板孔中，每孔200 μL，放入酶標(biāo)儀中測(cè)定各孔吸光度，按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度×標(biāo)準(zhǔn)管質(zhì)量濃度(0.563 g/L)

2.6 結(jié)果與分析

2.6.1 結(jié)果將干膏收率、氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度3個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的歸一值，各指標(biāo)“歸一值”求算幾何平均值，得三者的總評(píng)“歸一值”(od)作為試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)安排及總評(píng)“歸一值”見(jiàn)表2?！皻w一值”公式采用Hasson法［13］:

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.6.2 模型擬合采用Design-Expert7軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合回歸方程。多元線性回歸方程為:OD=0.48－0.19A－0.009 473B+0.1C(R=0.716 2，P=0.000 1)。二次多項(xiàng)式方程為:OD=0.55－0.19A－0.009 473B+0.1C－0.011AB－0.002 769AC－0.021BC－0.078A2－0.013B2－0.018C2(R=0.830 9，P=0.007 0)。由擬合結(jié)果中的置信度P值和相關(guān)系數(shù)R值而言，二次多項(xiàng)式模型相對(duì)于線性擬合有較大提高。

2.6.3 效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)根據(jù)上述二次多項(xiàng)式模型，分別繪制效應(yīng)面和等高線，并優(yōu)選3個(gè)因素的最佳取值范圍。結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

圖1 OD值與A、B因素的效應(yīng)面圖

圖2 OD值與A、C因素的效應(yīng)面圖

圖3 OD值與B、C因素的效應(yīng)面圖

根據(jù)效應(yīng)面圖和等高圖，選取較佳工藝范圍:溶媒含乙醇量14.79%～18.0%，提取時(shí)間70～80 min，溶媒用量10～12倍。結(jié)合溶液配制的實(shí)際操作和工業(yè)生產(chǎn)可行性等因素，確定提取工藝的優(yōu)化條件為:加入11倍15%的乙醇，提取75 min。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)按該優(yōu)選工藝進(jìn)行提取3次，并比較預(yù)測(cè)值與真實(shí)值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 最佳提取值范圍

3 結(jié)論

美洲大蠊優(yōu)化提取條件為:取美洲大蠊藥材，加11倍量的15%乙醇提取兩次，每次75 min，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩選美洲大蠊最佳提取條件方法可行，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)值良好。

4 討論

4.1 氨基酸測(cè)定方法的確定經(jīng)現(xiàn)代研究表明，美洲大蠊含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素等化學(xué)成分［14］，藥理功效眾多，如能抗腫瘤［15］、抗菌抗毒素、抗炎鎮(zhèn)痛。雖然其食用和藥用價(jià)值逐漸引起人們的重視，但對(duì)該藥的藥用價(jià)值評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究較少、穩(wěn)定的評(píng)價(jià)方法也鮮見(jiàn)。根據(jù)對(duì)美洲大蠊的研究報(bào)道［16-17］，本試驗(yàn)確定以氨基酸含有量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一來(lái)評(píng)價(jià)提取工藝優(yōu)劣。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)目前測(cè)定氨基酸的方法適用性差且重現(xiàn)性不好，不適用于測(cè)定美洲大蠊中的氨基酸，因此，在星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)前，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有測(cè)定氨基酸的方法進(jìn)行了改進(jìn)，確定了制備供試品溶液時(shí)量取0.15 mL濾液來(lái)測(cè)定吸光度，所得的吸光度值在線性范圍內(nèi)。最終建立的美洲大蠊中氨基酸定量測(cè)定的方法具穩(wěn)定可行、重復(fù)性好、靈敏度高。

4.2 提取溶媒范圍的確定目前關(guān)于美洲大蠊有效成分的提取方法報(bào)道中主要溶媒有95%乙醇、90%乙醇、70%和水，因此本試驗(yàn)以文獻(xiàn)報(bào)道中的溶媒進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明使用較高含醇量的乙醇為溶媒時(shí)不利于干膏的提取和氨基酸、蛋白質(zhì)的溶出，因此本試驗(yàn)最終選取的溶媒范圍極限值為水和70%乙醇，旨在保證較高的指標(biāo)成分提取率和較優(yōu)的篩選范圍基礎(chǔ)上，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化篩選出以干膏收率、氨基酸提取量和蛋白質(zhì)提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)的最優(yōu)溶媒提取含乙醇量。

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