高效液相色譜-質譜法測定血漿中槲皮素及其主要代謝產(chǎn)物

王增仙

（山西生物應用職業(yè)技術學院生物制藥工程系，山西 太原 030031）

黃酮是廣泛存在于植物中的多酚類化合物，槲皮素是黃酮醇類化合物的典型代表，它最顯著的特點是抗氧化性強，是植物界分布最廣的黃酮類化合物，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮。人們日常飲食中的洋蔥、蘋果、紅酒中就含有大量的黃酮醇類化合物［1］。已有的研究結果表明槲皮素具有抗氧化、抗癌防癌、抗炎癥反應、調節(jié)免疫功能等活性，在防治慢性退行性疾病過程中發(fā)揮重要作用［2-4］。槲皮素等黃酮類化合物也是中藥及其復方中的主要活性成分之一，受到國內外學者的關注。實驗動物或人通過口服攝入槲皮素后，槲皮素在血漿中的物質形式以及代謝產(chǎn)物的情況一直是研究的熱點。腸代謝［5］以及體內生物利用度［6］研究表明槲皮素代謝中只有很少或者沒有槲皮素糖苷配基存在［7］，其代謝物主要是經(jīng)由小腸或者肝臟代謝以槲皮素葡萄糖醛酸，槲皮素硫酸鹽，氧-甲基化槲皮素以及氧-甲基化槲皮素葡萄糖醛酸的形式存在［8］。陳峰等采用液相色譜-質譜聯(lián)用法，在大氣壓電噴霧離子源負離子條件下，測定了大鼠口服槲皮素單體后血漿中槲皮素和異鼠李素［9］。安代志等［10］采用高效液相-質譜聯(lián)用的方法分析經(jīng)口給予槲皮素后大鼠門靜脈血槲皮素及其代謝產(chǎn)物，結果表明槲皮素處理大鼠門靜脈血中可以檢測到一定質量濃度的槲皮素以及異鼠李素、檉柳黃素、槲皮素硫酸酯、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸等。本實驗通過液相色譜-質譜聯(lián)用技術測定人口服槲皮素后血漿中的槲皮素及其代謝產(chǎn)物，為研究含槲皮素等黃酮類成分中藥及其復方藥動學研究以及血樣濃度檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀 (ACQUITY UPLC-Quattro Premier XE，美國 Waters公司)。Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)。乙腈(Sigma-Aldrich公司，色譜純)，甲醇(Sigma-aldrich公司，色譜純)，甲酸(Sigma-Aldrich公司，色譜純)，水為Milli-Q超純水。

槲皮素(批號:Q4951)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸(批號:90733)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷(批號:16654)，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸(自制，經(jīng) MS和NMR鑒定)，芹菜素(批號:42251)，抗壞血酸(批號:A5960)購于Sigma-aldrich公司。

1.2 對照品溶液的制備 取槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品適量，精密稱定，溶于甲醇，制備成質量濃度為0.05 mg/mL的貯備液。取抗壞血酸適量，精密稱定，加入甲醇制備成質量濃度為10 mg/mL的溶液。所得貯備溶液均置于4℃冰箱避光保存。

1.3 超高效液相色譜-質譜測定條件 色譜條件:Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；流動相 A 為1%甲酸水溶液、B為1%甲酸乙腈溶液梯度洗脫，0 min，B為5%；10 min，B為 38%；10～12 min，B為 38%；12～14 min，B為100%；14～14.5 min，B為100% ～5%；14.5～15.5 min，B為5%；體積流量0.40 mL/min；柱溫40°C；進樣5 μL。質譜條件:儀器為Waters公司Quattro Premier XE串聯(lián)質譜儀。電噴霧離子源(ESI)，采用負離子模式檢測；脫溶劑氣流量為600 L/h，脫溶劑氣溫度為350℃，錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度為120℃，毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為35 V；選擇離子監(jiān)測模式，檢測離子質荷比為301.1(槲皮素)，477.1(槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸)，463.2(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)，491.2(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸)，269.1(芹菜素)，裂解電壓分別為40 V，30 V，40 V，25 V，50 V。

1.4 生物樣品制備 血漿樣品的處理根據(jù)文獻［11］進行微小變動后操作。100 μL血漿樣品用10 μL 20% 甲酸溶液酸化，加入10 μL抗壞血酸 (10 mg/mL)防止樣品處理過程中黃酮類成分的氧化。300 μL乙腈(含400 ng/mL內標物芹菜素)加入到血漿樣品中用于沉蛋白以及提取黃酮類化合物。上述血漿樣品混懸10 min，超聲5 min，在4℃下13000 r/min離心20 min，收集上清液。殘渣繼續(xù)加入300 μL的甲醇按照上述步驟進行第二次提取。合并乙腈與甲醇提取液，真空濃縮至干，提取物用50 μL甲醇和100 μL 1%甲酸水溶液復溶，搖勻，過0.22 μm濾膜，進樣分析。

2 方法與結果

2.1 專屬性考察 分別取空白血漿、均勻混合的槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的混合對照品溶液以及加入內標芹菜素的健康受試者給藥后收集的血漿樣品，依1.4項方法操作，得圖1。由圖可以看出各物質分離度較好，槲皮素的保留時間約為8.09 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的保留時間約為5.26 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的保留時間約為5.25 min，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的保留時間約為6.38 min，內標芹菜素的保留時間為9.39 min。結果表明，采用選擇離子模式，空白血漿中內源性物質不干擾目標物的測定。

圖1 UPLC-MS色譜圖

2.2 線性關系考察 精密吸取上述對照品貯備液，稀釋成0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 μg/mL的對照品溶液，分別注入液質聯(lián)用儀，按上述條件測定槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的吸收峰峰面積，以進樣量為橫坐標(x)，以峰面積積分值為縱坐標(y)，進行回歸處理，上述物質回歸方程分別為:y=2.43x+98.708，r=0.9970(槲皮素)；y=1.71x+22.083；r=0.9997(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)；y=1.191x+16.294，r=0.9996(槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸)；y=0.78x+18.861，r=0.9980(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸)。結果表明，槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品分別在5～1280 ng/mL范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗 精密吸取槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品溶液各2 μL，重復進樣6次，測定槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品的峰面積，槲皮素峰面積的RSD為1.67%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸峰面積的RSD為1.92%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷峰面積的RSD為2.33%，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸峰面積的RSD為2.15%。

2.4 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液1份，分別于0、0.5、1、2、4、8、16 h 進樣測定，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸積分面積的RSD分別為3.68%，2.97%和4.52%，表明供試品溶液在16 h內穩(wěn)定。

2.5 重復性實驗 取同一供試品溶液約100 μL，平行制備6份，按樣品的測定方法進行測定，計算槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸質量濃度，結果RSD分別為2.53%，3.16%和3.42% ，表明本方法重復性較好。

2.6 提取回收率 以槲皮素-3-O-葡萄糖苷為例，將槲皮素-3-O-葡萄糖苷標準液加入空白血漿中，分別配制5.0，20.0和80.0 μg/L 3個質量濃度的質控樣品，每個質量濃度5份，依1.4項方法操作，記錄槲皮素-3-O-葡萄糖苷的峰面積A血漿；另取高、中、低3個質量濃度槲皮素-3-O-葡萄糖苷質控液，經(jīng)流動相稀釋10倍后直接進樣分析，每個質量濃度5份，記錄槲皮素-3-O-葡萄糖苷的峰面積A標品，則血漿中槲皮素-3-O-葡萄糖苷提取回收率(%)=A血漿/A標品×100%，相對回收率用實測質量濃度平均值與標示質量濃度的比值百分數(shù)(%)表示，結果見表1。結果表明日間、日內精密度及相對回收率均滿足生物樣品分析的要求。代謝物槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸經(jīng)同樣方法測定，結果表明也滿足生物樣品分析的要求。

表1 血漿樣品中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的回收率與精密度(n=5)

2.7 樣品測定結果 健康男性志愿者(n=6)分別口服槲皮素 200 mg，志愿者分別在服藥前、服藥后 0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取前臂靜脈血4 mL，置肝素抗凝管內、離心(4000 r/min，10 min)分離出血漿，置－80℃冷凍保存?zhèn)溆?。?.4項方法處理血漿樣品，本實驗測定了0.5，1 h采集血漿中物質濃度來驗證本實驗方法的可行性。在各分析批次樣品中均勻隨機放置高、中、低3個質量濃度的質控樣品，以此來監(jiān)控分析過程的有效性。定量測定結果見表2。

表2 樣品定量測定結果 (n=5)

3 討論

3.1 采用UPLC-MS/MS，能夠定性人口服槲皮素后血漿樣品中槲皮素及其幾種代謝產(chǎn)物，例如槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的保留時間約為5.26 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的保留時間約為5.25 min，但采用選擇離子模式，由于槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的檢測離子質荷比為477.1，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的檢測離子質荷比為463.2，因此可以準確定性?？瞻籽獫{中內源性物質不干擾目標物的測定。

3.2 槲皮素等黃酮類物質很容易氧化，因此在處理過程中加入抗壞血酸防止樣品的氧化，同時樣品必須在盡可能短的時間內測定。

3.3 通過對人口服槲皮素后血漿中代謝物的研究發(fā)現(xiàn)，血漿中檢測不到槲皮素原形藥物，說明血漿中槲皮素以結合物的形式存在。現(xiàn)有文獻報道［12］槲皮素在體內以槲皮素、異鼠李素、檉柳素與葡萄糖醛酸及硫酸形成結合物，通過液相-質譜聯(lián)用技術確定最終物質形式。

3.4 在有關槲皮素等黃酮類成分的體內藥物分析時樣品中常加入芹菜素(Apigenin)作為內標物，用以校準和消除由于操作條件的波動而對分析結果產(chǎn)生的影響，以提高分析結果的準確度。

3.5 通過對人口服槲皮素單體后血漿中的代謝產(chǎn)物的研究，了解槲皮素的入血形式，為含有槲皮素成分的中藥材及其復方制劑的藥代動力學研究提供科學依據(jù)。

［1］Crozier A，Lean M E J，McDonald M S，et al.Quantitative analysis of the flavonoid content of commercial tomatoes，onions，lettuce and celery［J］.J Agric Food Chem，1997，45(3):590-595.

［2］王艷芳，王新華，朱宇同.槲皮素藥理作用研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(2):171-173.

［3］秦曉蓉，張銘金，高緒娜，等.槲皮素抗菌活性的研究［J］.化學與生物工程，2009，26(4):55-57.

［4］Graf B A，Mullen W，Caldwell S T，et al.Disposition and metabolism of［2-14C］quercetin-4'-glucoside in rats［J］.Drug Metab Dispos，2005，33(7):1036-1043.

［5］Spencer J P，Chowrimootoo G，Choudhury R，et al.The small intestine can both absorb and glucuronidate luminal flavonoids［J］.FEBS Lett，1999，458(2):224-230.

［6］Scheline R R.CRC Handbook of mammalian metabolism of plant compounds［M］.Boca Ranton:CRC Press，1999:243-295.

［7］Scalbert A，Williamson G.Dietary intake and bioavailability of polyphenols［J］.J Nutr，2000，130(8S)，2073S-2085S.

［8］Morand C，Manach C，Crespy V，et al.Respective bioavailability of quercetin aglycone and its glycosides in a rat model［J］.Biofactors，2000，12(1-4)，169-174.

［9］陳 峰，任守忠，魏 娜，等.液相色譜-質譜聯(lián)用法測定大鼠血漿中的槲皮素代謝物［J］.中國藥學雜志，2008，43(3):225-227.

［10］安代志，吳勝明，韋京豫，等.大鼠灌胃槲皮素后門靜脈槲皮素及其代謝產(chǎn)物的液質分析［J］.衛(wèi)生研究，2009，38(4):417-419.

［11］Day A J，Mellon F，Barron D，et al.Human metabolism of diet-ary flavonoids:identification of plasma metabolites of quercetin［J］.Free Rad Res，2001，35(6):941-952.

［12］Claudine M，Gary W，Christine M，et al.Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans(I)Review of 97 bioavailability studies ［J］.Am J Clin Nutr，2005，81(1S):230S-242S.