畢赤酵母重組表達(dá)抗菌肽Fowlicidins的研究進(jìn)展

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所 許文杉 馮興軍

抗菌肽因具有分子量小、熱穩(wěn)定性高、殺菌范圍廣、作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)，成為抗生素替代品的重要候選物，但其制備一直是研究與應(yīng)用的瓶頸?；蚬こ谭椒ㄊ墙鉀Q抗菌肽制備難題的有效途徑。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)（Pichia pastoris）是目前抗菌肽基因和生物工程中重要的、應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代初興起的一種新型真核表達(dá)系統(tǒng)，具有基因重組操作相對(duì)簡(jiǎn)單、能正確加工與修飾外源蛋白、表達(dá)量高、易純化且易大量發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。迄今為止，已有400多種蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中成功高效表達(dá)（Cereghino和Cregg，2000）。運(yùn)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Fowlicidins抗菌肽具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。Fowlicidins是雞體內(nèi)的一類新型的Cathelicidin抗菌肽，其前體分子的氨基端含有一個(gè)高度保守的cathelin前片段，而羧基端的氨基酸序列具有特異性，具有廣譜的抗菌活性和避免抗菌劑耐藥性的潛能，是理想的候選抗菌藥物。

1 Fowlicidins的基本簡(jiǎn)介

1.1 Fowlicidins的基因結(jié)構(gòu)和組織分布 迄今為止，已在雞基因庫(kù)中搜索到13種雞β-防御素，4種cathelicidins和1種新的肝臟表達(dá)的抗微生物肽（LEAP-2），其中cathelicidins的研究主要集中于哺乳動(dòng)物有關(guān)于雞的研究報(bào)道較少（Ramanathan 等，2002）。 雞 cathelicidins包括 Fowlicidin-1 （cathelicidin-1，chCATH-1）、Fowlicidin-2（cathelicidin-2，chCATH-2）、Fowlicidin-3（cathelicidin-3，chCATH-3） 等 （Goitsuka 等 ，2007）。Fowlicidin在N端有一個(gè)高度保守的cathelin前序列，屬于cathelicidin家族。編碼Fowlicidins的3個(gè)基因都具有相似的結(jié)構(gòu)，即4個(gè)外顯子被3個(gè)內(nèi)含子間隔開來，起始的3個(gè)外顯子編碼信號(hào)肽和cathelin前片段，而最后的一個(gè)外顯子主要編碼成熟片段。這種基因結(jié)構(gòu)類型與哺乳動(dòng)物Cathelicidins基因結(jié)構(gòu)類型是完全一致的，明確地指示出Cathelicidins基因在生物進(jìn)化過程中有重要的保守性（Herr等，2007；Mookherjee 等，2007）。從Fowlicidins的起源來看，F(xiàn)owlicidin-1和Fowlicidin-3的產(chǎn)生很可能是基因復(fù)制的結(jié)果，因?yàn)槠湔麄€(gè)可讀框有著明顯的相似性，并且其基因的內(nèi)含子片段也有很高的相似性。Fowlicidin-2與Fowlicidin-1和Fowlicidin-3相比，在前三個(gè)外顯子編碼的肽片段上同樣有著明顯的同源性，但是在最后一個(gè)外顯子編碼的肽片段上卻有著很大的不同，或許Fowlicidin-2基因是直接從Fowlidicin-1或Fowlicidin-3復(fù)制而來的，但不是經(jīng)過外顯子改組而得來的，因而，家禽（雞）可能借此方式產(chǎn)生了在最后一個(gè)外顯子上有明顯序列趨異的多種Cathelicidins（史春林，2008）。

成熟的雞Fowlicidins是富含精氨酸的單鏈分子，氨基酸數(shù)量為26～32，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、產(chǎn)單孢李氏菌等細(xì)菌對(duì)其高度敏感。Albert等（2005）從雞骨髓細(xì)胞中克隆出一種新奇的雞cathelicidin——雞骨髓抗菌肽，命名為 CMAP27。 隨后，Xiao 和 Yi（2006）從雞肝臟中克隆出3種雞Cathelicidins，即Fowlicidin-1，F(xiàn)owlicidin-2和Fowlicidin-3，其中Fowlicidin-3與CMAP27通過序列比對(duì)有100%同源性，應(yīng)該視為同一抗菌肽。Fowlicidins在盲腸扁桃腺、法氏囊和骨髓中的表達(dá)量很高，在皮膚組織有表達(dá)量較低，但是在尾脂腺中卻有極高的表達(dá)量。以上此類分泌型的腺油脂含有抗菌特性的烷基代石蠟酸和乙醇，可以為禽類抗感染提供保護(hù)作用。鑒于Cathelicidin類抗菌肽在與哺乳動(dòng)物皮膚相關(guān)的先天免疫中發(fā)揮重要的效應(yīng)作用，或許Fowlicidins對(duì)宿主也有同樣的作用 （Zanetti等，2002；Cole等，2001）。因此，F(xiàn)owlicidins短肽與腺油脂一同分泌，遍布全身羽毛和皮膚，其可能對(duì)抗皮膚病原菌的先天免疫有重要作用。

1.2 Fowlicidins的抗菌特性和抗菌機(jī)制 Fowlicidin-3在畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌均有一定抑菌活性，目的蛋白分子質(zhì)量約3.1 kDa，所表達(dá)的抗菌肽Fowlicidin-3有作為抑菌藥物的潛力 （陳軼群等，2009）。雞源Fowlicidin-3抗菌肽具有較強(qiáng)的熱、酸穩(wěn)定性，對(duì)致病性大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌CowanⅠ的最小抑菌濃度分別為 3.12、1.56μg/mL 和 1.56μg/mL。 在對(duì)大腸桿菌O1感染雛雞的體內(nèi)療效試驗(yàn)中，雞源Fowlicidin-3顯示出了較好的預(yù)防和治療效果（李榮榮等，2011）。相對(duì)而言，重組抗菌肽Fowlicidin-1的抑菌作用更為廣泛，對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)單孢李氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用（史春林，2008）。還有試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)owlicidins對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度在0.4～2.0μg/mL，并有較強(qiáng)的結(jié)合內(nèi)毒素能力，而且還具有強(qiáng)有力的、不依賴鹽離子的、廣譜的抗菌活性，是目前已知的活性最強(qiáng)的抗菌肽之一 （Xiao和Yi，2006）。Fowlicidins抑制大腸桿菌所需的最小藥物濃度（MIC）為1.59～2.66μg/mL。SMAP-29是目前所報(bào)道的最有效的Cathelicidin抗菌肽，與其相比，F(xiàn)owlicidins表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌特性 （Zanetti等，2002；Shin等，2001）。但是，與多數(shù)抗菌肽不同的是Fowlicidins抗菌活性不受生理鹽濃度的影響，甚至在NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，仍然保持著抗菌活性，并且對(duì)抗性菌株有很強(qiáng)的抑制作用，這意味著Fowlicidins在抗感染治療應(yīng)用上有著很大的潛力。

到目前為止，F(xiàn)owlicidins的確切抗菌機(jī)制還沒有被確定。普遍認(rèn)為Fowlicidins是通過在微生物壁膜上形成多聚體孔道而裂解細(xì)胞的。Bommineni等（2007）研究表明，F(xiàn)owlicidins是以多聚體的形式作用于微生物膜壁上，并在其上形成膜孔；Fowlicidins首先以單體或多聚體的形式通過靜電作用結(jié)合在膜上，然后互相識(shí)別形成多聚體并插入到膜的疏水核中，并與膜的脂層相互作用形成通道；同時(shí)其他單體或小的多聚體繼續(xù)結(jié)合上來使通道的孔徑擴(kuò)大，細(xì)菌因而失去膜勢(shì)，不能保持正常滲透壓而死亡。顯然，不同的抗菌肽采用不同的抗菌機(jī)制，并且對(duì)于一個(gè)給定的抗菌肽其作用模式同樣因作用菌種的不同而有所不同（Ramanathan等，2002）。 因此，進(jìn)一步探究 Fowlicidins的疏水性、凈帶正電荷量、構(gòu)象的柔韌度以及二級(jí)結(jié)構(gòu)與其抗菌作用之間的相互關(guān)系，對(duì)揭開Cathelicidins類抗菌肽的作用機(jī)制及其在抗感染應(yīng)用方面都有積極意義。

2 Fowlicidins在畢赤酵母中的表達(dá)

2.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有繼代穩(wěn)定，可以高密度發(fā)酵，在發(fā)酵過程中自身分泌的蛋白少，外源蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，而且在其分泌表達(dá)抗菌肽時(shí)，自身不受其殺菌活性的影響，還能保證抗菌肽分子的正確結(jié)構(gòu)和適度的糖基化，從而保證其天然活性，是一種高效蛋白表達(dá)體系（唐元家和余柏松，2002）。

2.2 影響Fowlicidins表達(dá)的因素 在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，影響Fowlicidins外源性基因表達(dá)因素有目的基因的拷貝數(shù)、目的基因的特性、甲醇利用表型、產(chǎn)物穩(wěn)定性和培養(yǎng)條件等。

2.2.1 目的基因的拷貝數(shù) 由于基因的劑量效益，隨著克隆中拷貝數(shù)的增加，蛋白質(zhì)的表達(dá)可能會(huì)增加。多拷貝整合有利于充分發(fā)揮畢赤酵母的表達(dá)潛能。Vacca等（2000）的研究結(jié)果顯示，在1～8整合拷貝數(shù)范圍內(nèi)，HBsAg表達(dá)量隨基因劑量的增加而成比例升高。也有極少研究表明，增加拷貝數(shù)反而降低了表達(dá)水平（Karine和Dev，2010）。由此可見，基因整合拷貝數(shù)與表達(dá)水平間并不是簡(jiǎn)單的正比關(guān)系，有時(shí)拷貝數(shù)增加反而會(huì)對(duì)表達(dá)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，高拷貝低表達(dá)的原因可能在于mRNA翻譯、蛋白質(zhì)折疊效率的限制，這和目的蛋白的大小、結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。基因拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)量的影響很難預(yù)測(cè)，所以在獲得多拷貝重組子的基礎(chǔ)上，要進(jìn)一步篩選確定因具有合適拷貝數(shù)而顯示最佳表達(dá)水平的菌株，也就是高表達(dá)菌株的篩選應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為最終標(biāo)準(zhǔn)?？衫肧DS-PAGE、菌落免疫印跡和活性分析等方法檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

2.2.2 目的基因的特性 由于特定的A+T富含區(qū)可作為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，因此高A+T含量的外源基因在此系統(tǒng)中不能有效的轉(zhuǎn)錄 （李琦等，2005）。外源基因序列中的mRNA 5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）的核苷酸序列和長(zhǎng)度是影響外源基因能否高效表達(dá)的又一重要因素。此外，在設(shè)計(jì)基因時(shí)選用畢赤酵母偏好密碼子可提高轉(zhuǎn)錄的成功率。

2.2.3 甲醇利用表型 使用不同的宿主菌或線性化酶切位點(diǎn)，可產(chǎn)生不同的甲醇利用表型。然而很難將轉(zhuǎn)化子表型與表達(dá)量之間建立明確和必然的關(guān)系，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)情況，考察自身基因在各表型各菌株中的表達(dá)情況，最終選擇特定的株型（Dai等，2000）。

2.2.4 產(chǎn)物穩(wěn)定性 外源蛋白對(duì)蛋白酶的敏感與否也影響蛋白的產(chǎn)量。通常采用調(diào)整pH改變酶活性；培養(yǎng)基中添加1%酪氨酸蛋白水解物；或使用蛋白酶缺陷受體菌SMD1168來減少蛋白酶對(duì)外源基因表達(dá)的影響（Sreekrishna等，1997）。

2.2.5 培養(yǎng)條件 外源基因的表達(dá)水平受培養(yǎng)基組成、緩沖液pH、甲醇濃度、培養(yǎng)溫度、通氣狀況、誘導(dǎo)物濃度及時(shí)間等因素的影響。

3 展望

隨著對(duì)Fowlicidins等相關(guān)抗菌肽研究的不斷深入，必將開創(chuàng)治療微生物感染類疾病的新紀(jì)元?？紤]到Fowlicidins有著強(qiáng)有力的、不依賴鹽離子的、廣譜的抗菌活性，在機(jī)體免疫中有一定調(diào)節(jié)作用；而且其抗菌機(jī)制完全不同于傳統(tǒng)抗生素，因此通過基因工程方法，利用細(xì)胞依賴或無細(xì)胞型蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組Fowlicidins抗菌肽將會(huì)有重大意義（Ingham和Moore，2007）。目前研究的重點(diǎn)是如何實(shí)現(xiàn)抗菌肽產(chǎn)量的突破，以滿足試驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用的需求。隨著Fowlicidins表達(dá)量的不斷提高，對(duì)其抗菌機(jī)制的深入研究、臨床抗微生物活性鑒定及在其他藥學(xué)應(yīng)用上的評(píng)定有很大推進(jìn)作用。

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