TDM/TDB是結(jié)核亞單位疫苗的重要佐劑

孫 蕾 鄭錦輝 戚 巍 唐詩邈 綜述 郭軍巧 審校 (遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽110005)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，每年造成全球二百萬人死亡[1]，我國結(jié)核病患者人數(shù)僅次印度，位于世界第二位。我國結(jié)核病的耐藥狀況不容樂觀，耐多藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)給結(jié)核病的防治帶來巨大的挑戰(zhàn)[2]。在多數(shù)高負(fù)擔(dān)的發(fā)展中國家，由于環(huán)境中的細(xì)菌長期誘導(dǎo)低水平的抗菌免疫，卡介苗(BCG)缺乏有效性，急需研制有效的結(jié)核疫苗控制結(jié)核疫情[3]。重組結(jié)核蛋白亞單位疫苗Ag85B-ESAT6(H1)正是一種極具前景的新型疫苗。H1是 MTB蛋白Ag85B和ESAT6的融合物[1]，H1有效誘導(dǎo)抗菌免疫需要使用能活化抗原提呈細(xì)胞(APC)的佐劑。氧化鋁能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，但對控制細(xì)胞內(nèi)感染的T細(xì)胞應(yīng)答無效。弗氏完全佐劑(CFA)能有效誘導(dǎo)Th1細(xì)胞活化，但毒性太大。索因子正6，6-二霉菌酸海藻糖(TDM)及其合成類似物6，6-二十二酸酯海藻糖(TDB)是結(jié)核亞單位疫苗的有效佐劑[4，5]，能與重組H1疫苗共同誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1免疫應(yīng)答。糖脂佐劑TDM/TDB通過活化固有免疫應(yīng)答啟動Th1和Th17免疫機(jī)制的研究對于充分發(fā)揮疫苗的保護(hù)作用具有重要意義。TDM/TDB作用于APC的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和發(fā)揮免疫刺激活性的分子機(jī)制成為疫苗研制的關(guān)鍵。

1 TDM/TDB激活固有免疫程序，活化Th1和Th17細(xì)胞功能

哺乳動物免疫包含兩個(gè)系統(tǒng)，即固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。固有免疫作為防御的第一道防線，幾分鐘內(nèi)快速發(fā)現(xiàn)、識別病原體，未成熟的抗原提呈細(xì)胞吞噬、攝取抗原，同時(shí)與佐劑的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)接觸而成熟，進(jìn)而提呈抗原并活化初始 T細(xì)胞，啟動抗原特異的獲得性免疫應(yīng)答[6]。

1.1 TDB/TDM有效活化抗原提呈細(xì)胞(APCs)佐劑TDB/TDM能有效活化APC，誘導(dǎo)獲得性免疫。TDB能上調(diào)APC表面MHCⅡ分子和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)，刺激樹突狀細(xì)胞(DCs)和骨髓源巨噬細(xì)胞(Bone marrow-derived macrophage，BMMs)合成細(xì)胞因子和一氧化氮(NO)[5]。采用骨髓源巨噬細(xì)胞的合成物NO作為細(xì)胞活化的標(biāo)志，TDB/TDM能誘導(dǎo)骨髓源巨噬細(xì)胞合成大量NO。與TLR配體CpG對TLR刺激相比，佐劑TDB通過特定的細(xì)胞內(nèi)信號系統(tǒng)活化APCs。TDB選擇性誘導(dǎo)基因表達(dá)已在蛋白水平被證實(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)物的上清中能檢測到TDB刺激合成的白介素1β(IL-1β)[5]?；罨腄C其功能得到增強(qiáng)。

1.2 TDM/TDB促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞合成γ-干擾素和IL-17 為進(jìn)一步確定TDB佐劑誘導(dǎo)獲得性免疫的活性，用H1與TDB刺激淋巴結(jié)細(xì)胞Th1和Th17細(xì)胞應(yīng)答。TDB誘導(dǎo)強(qiáng)Th1細(xì)胞應(yīng)答，強(qiáng)烈誘導(dǎo)抗原特異性γ-干擾素的合成[7]，也能活化強(qiáng)Th17細(xì)胞應(yīng)答[8]。TDB免疫刺激能力主要依賴其對固有免疫系統(tǒng)的作用[5]。

2 TDM/TDB增強(qiáng)APC功能的分子機(jī)制

2.1 TDB/TDM誘導(dǎo)APC活化需要酪氨酸激酶SyK 多種模式識別受體(PRRs)通過不同的信號途徑調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞活性。多數(shù)TLR(Toll-like receptor)通過銜接蛋白MyD88傳遞信號[9]，免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)相連受體如C型凝集素受體采用激酶Syk作為下游信號。為了解TDB通過哪條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化細(xì)胞，采用 MyD88-/-和 Syk-/-BMMs觀察TDB對細(xì)胞的活化作用。在反應(yīng)體系中加入TLR受體活化劑后，Syk-/-細(xì)胞正常合成NO，MyD88-/-BMMs活化受抑制。相反，TDB/TDM誘導(dǎo)MyD88-/-細(xì)胞合成NO不受影響，但不能刺激Syk-/-細(xì)胞合成NO。TDB免疫后，MyD88-/-BMMs表達(dá)白介素6(IL-6)不受影響，而Syk-/-BMMs不能合成IL-6和IL-1β。小分子Syk抑制劑以劑量依賴的方式阻礙TDB/TDM誘導(dǎo)BMMs合成釋放NO[5]。因此，Syk的酶功能對 TDB/TDM 誘導(dǎo)非MyD88-/-依賴固有免疫細(xì)胞體外活化是很重要的。

2.2 銜接分子Card9是TDM/TDB發(fā)揮佐劑活性的重要分子 TDM/TDB活化巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞需要髓系細(xì)胞特異銜接蛋白Card9。TDB免疫后，Card9-/-細(xì)胞不能合成NO和上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、IL-6和IL-1β的表達(dá)。而CpG刺激Card9-/-細(xì)胞后，這些分子的表達(dá)在很大程度上不受影響。凝膠多糖(Curdlan)是C型凝集素受體Dectin-1的配體，由Card9傳遞信號。TDB和Curdlan刺激DCs合成IL-12p40、IL-12p70和 IL-12p23依賴于 Card9。在Card9缺乏的條件下，TDB和Curdlan誘導(dǎo)細(xì)胞活化的能力完全喪失，而CpG活化基因表達(dá)的能力不受影響。通過分析 DCs分泌 IL-1β、IL-6和 TNF-α發(fā)現(xiàn)，TDB嚴(yán)格地以Card9依賴的方式激發(fā)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的核移位[5]，Card9與下游銜接分子和支架蛋白BCL10和 Malt1結(jié)合，促進(jìn) NF-κB活化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[10]。因此，上述實(shí)驗(yàn)證明TDB、TDM在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)固有免疫，這一途徑依賴Syk激酶活化和銜接蛋白Card9、Bcl10和Malt1。

2.3 TDB/TDM需要ITAM受體-銜接蛋白FcRr識別 TDB/TDM不依賴Dectin-1受體激活A(yù)PC，但需要ITAM受體-銜接蛋白FcRr識別。用Curdlan不能刺激 Dectin-1-/-BMMs合成 NO，但 TDB、TDM、CpG和LPS不受影響，因此，TDB/TDM不依賴Dectin-1受體激活A(yù)PC。活化Syk的髓系細(xì)胞受體與銜接蛋白Dap12或FcRr之一有關(guān)[9]。為進(jìn)一步了解TDB/TDM活化 APC所需的信號分子，使用Dap12-/-BMMs和 FcRr-/-BMMs。TDB/TDM 刺激后，F(xiàn)cRr-/-BMMs表達(dá)的一氧化氮合酶2(Nitric oxide synthase2，NOS2)和合成的NO特異喪失，TDB/TDM誘導(dǎo) NOS2的表達(dá)不依賴于 Dap12。TDB/TDM誘導(dǎo)大量的IL-6表達(dá)特異需要FcRr。因此，ITAM受體相關(guān)銜接蛋白FcRr對于TDB/TDM識別Syk-Card9信號途徑是至關(guān)重要的[5]。

2.4 TDB/TDM與ITAM受體的特異結(jié)合 目前，特異識別TDB/TDM的受體已被查明，一些C型凝集素受體(Mincle、Dectin-2和 DCAR)，還有其它FcRr偶聯(lián)蛋白(OSCAR和PIRA)被認(rèn)為是候選受體[7]。其中，Mincle-Fc融合蛋白成劑量依賴的與TDM和TDB特異結(jié)合，說明細(xì)菌來源的糖脂TDM和TDB是Mincle受體的配體[11]。TDM由一個(gè)海藻糖和兩個(gè)霉菌酸鏈組成。兩者均不能單獨(dú)激活表達(dá)Mincle受體的細(xì)胞，這表明TDM的糖脂結(jié)合對于TDM與Mincle受體相互作用起到關(guān)鍵作用。TDM/TDB能上調(diào)C型凝集素受體Mincle在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，用定量RT-PCR檢測Mincle mRNA發(fā)現(xiàn)，TDM/TDB誘導(dǎo)的Mincle上調(diào)完全依賴于FcRr和Card9。Mincle受體識別結(jié)核分枝桿菌(MTB)的活性需要受體中糖類識別區(qū)域的EPN基序[12]。細(xì)菌索因子TDM或合成類似物TDB與Mincle受體結(jié)合，巨噬細(xì)胞表面的Mincle受體交聯(lián)，活化Mincle-FcRγ復(fù)合體，因此，與FcRr相結(jié)合的Mincle受體與糖脂TDB和TDM結(jié)合是激活巨噬細(xì)胞的必要條件，也是TDB和TDM發(fā)揮佐劑活性的關(guān)鍵。

總之，糖脂佐劑TDM和TDB與含免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)的受體結(jié)合，ITAM受體-銜接蛋白FcRr復(fù)合體活化，由FcRγ傳遞激活信號，通過Syk-Card9-Bcl10-Malt信號途徑將膜受體活性轉(zhuǎn)換為下游信號，促進(jìn)NF-κB活化，通過胞質(zhì)的信號級聯(lián)反應(yīng)途徑激活A(yù)PC。FcRr相結(jié)合的ITAM受體與糖脂TDB和TDM結(jié)合是激活A(yù)PC的必要條件，也是TDB和TDM發(fā)揮佐劑活性的關(guān)鍵。

3 銜接分子Card9是TDB/TDM發(fā)揮佐劑活性的關(guān)鍵

為了解Card9是否為亞單位疫苗H1和TDB誘導(dǎo)免疫保護(hù)所必需，用低劑量的MTB氣溶膠感染小鼠，6周后檢測肺組織中細(xì)菌量。含H1和TDB脂粒的疫苗可以使感染鼠肺部細(xì)菌的量明顯減少，而單獨(dú)H1脂粒疫苗沒有明顯效果。與對照相比，TDB和H1免疫不能減少Card9-/-鼠肺部細(xì)菌的集落數(shù)。證明在體內(nèi)Card9在TDB誘導(dǎo)的抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用，這種保護(hù)作用與Card9依賴的抗原特異Th17細(xì)胞活化有關(guān)，與H1特異的合成γ-干擾素的CD4+T細(xì)胞數(shù)量的增加無關(guān)[5]。

Card9-/-鼠選擇性的髓系細(xì)胞缺陷，淋巴細(xì)胞活性不受影響。在脂粒中僅加入H1疫苗注射后，對照鼠和Card9-/-鼠均出現(xiàn)短暫的腳掌腫脹。用含有H1疫苗和TDB/TDM的脂粒注射后，對照鼠腳掌迅速變厚，而Card9-/-鼠無變化。TDM或TDB誘導(dǎo)Card9-/-鼠淋巴細(xì)胞合成γ-干擾素的能力減弱，暗示 TDB/TDM誘導(dǎo) Th1細(xì)胞分化依賴于Card9。TDB/TDM誘導(dǎo)Card9-/-鼠淋巴細(xì)胞合成H1特異的IL-17的能力完全缺失，表明Card9在TDM/TDB誘導(dǎo) Th17細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[5]。因此，Card9是體內(nèi)TDB和TDM發(fā)揮佐劑活性必需的。

4 結(jié)語與展望

佐劑是絕大多數(shù)疫苗的組成成分，并發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌索因子TDM和其類似物TDB能活化固有免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)適合的、保護(hù)性的Th1和Th17反應(yīng)。用含佐劑TDM的亞單位疫苗免疫后，誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞水平與MTB刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫程度相一致。

佐劑TDM/TDB與抗原提呈細(xì)胞(APC)表面受體相結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化APC，分泌IL-1β、IL-6和IL-23等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作為細(xì)胞免疫應(yīng)答的第三信號共同誘導(dǎo)Th17分化[13，14]。TDM 和 TDB 通過 Syk-Card9 信號調(diào)節(jié)免疫保護(hù)機(jī)制是發(fā)展有效TB免疫戰(zhàn)略的基礎(chǔ)。對TDM、TDB佐劑活化固有免疫細(xì)胞分子機(jī)制及信號傳導(dǎo)途徑的研究使通過特異抗體調(diào)節(jié)疫苗反應(yīng)成為可能，對充分發(fā)揮疫苗功能和控制結(jié)核具有重要意義。

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