HPLC法測(cè)定4種益母草制劑中鹽酸水蘇堿及其標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)價(jià)

包小紅，周娟，伍丕娥

(四川省食品藥品檢驗(yàn)所，四川成都610097)

益母草為唇形科益母草屬植物L(fēng)eonurus japonicusHoutt.的地上部分，原名茺蔚，據(jù)文獻(xiàn)［1-2］可知，其主要化學(xué)成分為生物堿類(lèi)(鹽酸水蘇堿、益母草堿、益母草定、益母草寧等)、黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)、甾醇、有機(jī)酸、多種微量元素及脂肪。其中鹽酸水蘇堿是主要的活性成分之一，具有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，收縮子宮的作用，該成分的定量測(cè)定方法在《中國(guó)藥典》2010年版一部“益母草”項(xiàng)下已有收載［3］。

益母草制劑涉及的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1［4-6］。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀，參照文獻(xiàn)［7-8］，對(duì)4種益母草制劑中的鹽酸水蘇堿的定量測(cè)定方法進(jìn)行了研究和統(tǒng)一。

表1 益母草制劑的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters2695高效液相色譜儀-Waters2487紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，Empower工作站;Agilent1200高效液相色譜儀-AgilentDAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)，Chem-Station工作站;Agilent1200高效液相色譜儀-Alltech ELSD2000檢測(cè)器，Chem-Station工作站。

1.2 試藥甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。鹽酸水蘇堿對(duì)照品為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)110712-200709，含量測(cè)定用，含量以99.0%計(jì)，使用前于五氧化二磷減壓干燥12 h以上)。

2 溶液制備

2.1 對(duì)照品溶液取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加入甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.960 8 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品貯備液。其他不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液由貯備液稀釋得到。

2.2 供試品溶液取益母草顆粒粉末約1 g(或益母草片粉末0.5 g，益母草膠囊內(nèi)容物0.5 g，益母草膏1 g)，精密稱(chēng)定，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入0.5%鹽酸甲醇25 mL，稱(chēng)質(zhì)量，超聲30 min，放冷，用0.5%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得?；蛉∫婺覆蒈浤z囊內(nèi)容物適量，混勻，取約2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，置水浴中微熱，充分振搖，放冷，濾紙濾過(guò)，續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

3 色譜條件

采用Agilent SCX300陽(yáng)離子交換(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-磷酸(15∶85∶0.15)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)192 nm;柱溫30℃。在上述色譜條件下各色譜峰分離良好，輔料空白無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖

4 方法學(xué)考察

4.1 線性關(guān)系及定量限考察分別精密量取上述一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得回歸方程:Y=279 635.8X+37 818.6r=0.999 7。結(jié)果表明:鹽酸水蘇堿在0.238～19.04 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣具有良好的線性關(guān)系。由于本次樣品的水蘇堿含量差異大，有些極低，因此我們確定了一個(gè)定量限:精密量取鹽酸水蘇堿對(duì)照品(1.38 μg/mL)20 μL，按選定方法測(cè)定，結(jié)果S/N≈10，因此本品定量限為27.6 ng。

4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液(0.430 5 mg/mL)5 μL，按上述色譜條件中方法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD為0.19%。

4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取已配制好的鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液(0.402 2mg/mL)5 μL和供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下，分別于0、4、8、16 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果各溶液峰面積的RSD分別為1.75%(對(duì)照品)、1.66%(益母草顆粒)、1.66%(益母草膏)、1.42%(益母草片)、0.98%(益母草膠囊)。

4.4 耐用性試驗(yàn)取各劑型的同一批樣品，分別采用不同的HPLC色譜儀和SCX色譜柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同色譜儀和色譜柱的考察結(jié)果

4.5 重復(fù)性試驗(yàn)取各劑型同一批號(hào)樣品，按上述溶液制備項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，各制備6份，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果樣品中含鹽酸水蘇堿量分別為5.051 mg/g、RSD為0.73%(益母草顆粒)，3.913 mg/g、RSD為1.39%(益母草膏)，15.647 mg/g、RSD為0.69%(益母草片)，23.784 mg/g、RSD為0.61%(益母草膠囊)。

4.6 加樣回收試驗(yàn)精密量取鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液(1.205 mg/mL)1.3、1、2、3 mL，各6份，分別置150 mL具塞錐形瓶中，水浴上揮干甲醇。分別取已知含有量的益母草顆粒細(xì)粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.051 mg/g)0.5 g，益母草膏(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.913 mg/g)0.5 g，益母草片細(xì)粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.647 mg/g)0.25 g，益母草膠囊細(xì)粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.784 mg/g)0.25 g，各6份，精密稱(chēng)定，置上述具塞三角瓶中，精密加0.5%鹽酸甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)量，其余照供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，并按下列公式計(jì)算回收率，結(jié)果回收率分別為99.0%、RSD為0.98%(益母草顆粒)，98.1%、RSD為2.00%(益母草膏)，99.5%、RSD為1.79%(益母草片)，102.0%、RSD為0.79%(益母草膠囊)。

4.7 樣品測(cè)定依據(jù)建立的鹽酸水蘇堿定量測(cè)定方法，對(duì)212批益母草顆粒、60批益母草膏、14批益母草片、12批益母草膠囊及8批益母草軟膠囊進(jìn)行了考察。結(jié)果益母草顆粒含鹽酸水蘇堿量在0.04 mg/g～10.94 mg/g之間，益母草膏含鹽酸水蘇堿量在2.8 mg/g～11.2 mg/g(標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為不得少于3.6 mg/g)之間，益母草片含鹽酸水蘇堿量在8.4 mg/g～13.9 mg/g之間，益母草膠囊含鹽酸水蘇堿量在13.8 mg/g～23.1 mg/g之間，益母草軟膠囊含鹽酸水蘇堿量在7.5 mg/?！?.6 mg/粒之間，其中益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含有量差異極大。

5 討論

5.1 曾參照《中國(guó)藥典》2010年版一部“益母草”含量測(cè)定項(xiàng)下鹽酸水蘇堿的檢測(cè)方法，采用丙酰胺基柱，蒸發(fā)光檢測(cè)器測(cè)定，測(cè)定條件為流動(dòng)相乙腈-水(80∶20);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;空氣體積流量2.0 L/min;漂移管溫度80℃，對(duì)益母草顆粒和益母草片的水蘇堿含有量進(jìn)行了重復(fù)性考察，結(jié)果分離度高，重復(fù)性良好，且兩種方法所測(cè)定的含有量結(jié)果(采用相同的供試品溶液進(jìn)行比較)相近。但是，由于采用蒸發(fā)光檢測(cè)器時(shí)計(jì)算較復(fù)雜，且該儀器的普及率較紫外低，因此我們最終選定了紫外檢測(cè)器作為檢測(cè)方式。

5.2 提取溶劑分別考察了無(wú)水乙醇、70%乙醇、0.5%鹽酸乙醇、0.5%鹽酸甲醇、1%鹽酸甲醇和甲醇，結(jié)果溶劑為0.5%鹽酸甲醇時(shí)，水蘇堿的提取效率最高。

5.3 益母草顆?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)(本次試驗(yàn)涉及的樣品執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)為部標(biāo)［6］，現(xiàn)已收載入《中國(guó)藥典》2010年版一部，增加了水蘇堿的薄層鑒別及含測(cè)項(xiàng)目)中檢測(cè)項(xiàng)目嚴(yán)重缺失，除了常規(guī)檢查項(xiàng)，就只有一個(gè)生物堿的化學(xué)鑒別反應(yīng)，專(zhuān)屬性差，控制水平低，因此產(chǎn)品質(zhì)量混亂，含有量差異極大，而其它劑型因標(biāo)準(zhǔn)中均對(duì)水蘇堿含有量或生物堿含有量作出了控制，產(chǎn)品質(zhì)量情況相對(duì)較好。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)的完善和有效性對(duì)藥品質(zhì)量的控制有著重要的作用。

5.4 益母草片、膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的定量測(cè)定方法均采用的是雷氏鹽沉淀，以重量法或紫外分光光度法測(cè)定其總生物堿的含有量，專(zhuān)屬性差。益母草膏現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的水蘇堿定量測(cè)定采用的是薄層掃描法，該法在操作過(guò)程所受影響因素較多，可操作性較差，薄層板展開(kāi)時(shí)，展開(kāi)劑的比例和展開(kāi)環(huán)境(溫濕度)，薄層板固定相的厚度和緊密度，顯色時(shí)所噴顯色劑的量和在薄層板上的均勻度，均要影響最終的測(cè)定結(jié)果，該法重復(fù)性較差，容易造成結(jié)果的誤差，難以正確把握產(chǎn)品的含有量，本實(shí)驗(yàn)采用了HPLC法測(cè)定水蘇堿，前處理簡(jiǎn)單，方法統(tǒng)一，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果可以有效地反應(yīng)不同劑型或同一劑型樣品之間的質(zhì)量差異。

5.5 益母草軟膠囊本次樣品涉及3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ29422005-2010Z，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ00722009及批件2009B00079，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ29422005-2010Z)，其中定量測(cè)定方法各不相同(見(jiàn)表1)。從標(biāo)準(zhǔn)中看，含藥材量(每粒)最高的樣品其規(guī)定的含測(cè)限度反而較低，按照標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定該樣品，其測(cè)定結(jié)果也較別家樣品低，仔細(xì)分析原因后發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)準(zhǔn)樣品前處理方法較復(fù)雜，可操作性及重復(fù)性較差，可能導(dǎo)致其測(cè)定結(jié)果偏低。按照統(tǒng)一的定量測(cè)定方法對(duì)上述3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的樣品進(jìn)行考察，結(jié)果樣品含有量的高低與其每粒所含藥材量的高低完全一致.因此，檢驗(yàn)方法不合理，則檢驗(yàn)結(jié)果難以真實(shí)反應(yīng)產(chǎn)品的質(zhì)量;方法不一樣，則檢驗(yàn)結(jié)果相互之間也缺乏可比性。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典下冊(cè)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:2695.

［2］國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草精選本下冊(cè)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998:1601.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:272.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第13冊(cè)［S］.1997:175.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)21分冊(cè)［S］.2002:521.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第7冊(cè)［S］.1993:141.

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［8］張韻，黃瑞紅.HPLC法測(cè)定安坤益母草片中鹽酸水蘇堿的含量［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24(1):20-21.