地膚子抗真菌化學(xué)成分研究

徐云輝，黃浩，郭兆霞，張念，孔德云，華茉莉

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200040)

中藥地膚子為藜科植物地膚Kochia scoparia(L.)Schard的成熟果實(shí)，具有清熱利濕、祛風(fēng)止癢之功效，用于小便澀痛、陰癢帶下、風(fēng)疹、濕疹、皮膚瘙癢等癥［1］，臨床多以復(fù)方入藥［2-5］。現(xiàn)代一些藥理實(shí)驗(yàn)顯示其水煎劑及醇提物對(duì)一些皮膚真菌具有一定的抑制作用［6-7］。目前，對(duì)地膚子的生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，其抗真菌活性成分也并未見有明確報(bào)道。本研究采用超臨界萃取與系統(tǒng)溶劑法，制備地膚子的不同提取部位樣品，體外紙片擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗(yàn)顯示其正丁醇提取部位對(duì)白色念珠菌具有明顯的抑菌活性。由此采用多種色譜分離方法對(duì)地膚子的正丁醇提取部位開展了化學(xué)成分研究，分離得到8個(gè)化合物，依據(jù)其理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)分別鑒定為β-谷甾醇(1)，β-胡蘿卜苷(2)，槲皮素(3)，金絲桃苷(4)，3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸(也稱地膚子皂苷ⅠC)(5)，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)，3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(也稱地膚子皂苷ⅡC)(7)，3-O-［β-D-吡喃葡萄糖(1→2)β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸(8)，其中化合物3、4、6均為首次從該植物中分離得到。體外抗真菌活性測試顯示，化合物8對(duì)白色念珠菌有一定抑制作用。

1 儀器和材料

MSD—Trap—XCT，Q—Tof micro(ESI-MS)型質(zhì)譜儀(Agilent公司);DRX—500核磁共振儀(Bruker公司);WFH—203三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司);Waters高效液相色譜儀(2487檢測器，1525二元泵);硅膠H(煙臺(tái)芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠);Sephadex LH-20凝膠(安發(fā)瑪西亞);ODS—A反相硅膠填料(日本YMC公司);Rf200中低壓制備色譜(環(huán)球)。

地膚子購于上海雷允上中藥飲片廠，批號(hào)2009100238，經(jīng)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院吳彤研究員鑒定為藜科植物地膚的果實(shí)。

白色念珠菌為上海醫(yī)藥工業(yè)研究院微生物部門保藏菌種。

2 提取分離

干燥地膚子藥材4 kg，粉碎，經(jīng)CO2超臨界萃取除去油脂，藥渣以80%乙醇回流提取3次，提取液濃縮，所得浸膏采用硅藻土拌樣(1∶1)，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫，所得甲醇部位再以水飽和正丁醇萃取得正丁醇部位。正丁醇部位(100 g)經(jīng)硅膠柱層析以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，其95∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫)得化合物1(30.3 mg);其15∶1洗脫部位經(jīng)乙醇重結(jié)晶得化合物2(35.5 mg)，其結(jié)晶母液部分經(jīng)LH-20凝膠柱層析得化合物3(8.4 mg);其8∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析得化合物5(45.5 mg)，HPLC(甲醇-水系統(tǒng))精制得化合物6(10.0 mg);其6∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析得化合物4(9.3 mg);其1∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析、中低壓反相硅膠柱層析(甲醇-水梯度洗脫)得化合物7(84.5 mg)、化合物8(102.5 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色針晶(甲醇)，mp 140～141℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性。經(jīng)與β-谷甾醇對(duì)照品共薄層，在3種溶劑系統(tǒng)下展開Rf值均一致，混合后測定熔點(diǎn)不下降，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物2:白色粉末，mp 275～277℃，難溶于水、甲醇、三氯甲烷;Libermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽性，經(jīng)與胡蘿卜苷對(duì)照品共薄層，在3種溶劑系統(tǒng)下展開Rf值一致，混合后測定熔點(diǎn)不下降，故鑒定該化合物為β-胡蘿卜苷。

化合物3:黃綠色粉末，ESI-MS m/z:301［MH］－，325［M+Na］+，分子式C15H10O7。1H-NMR(MeOH-d4，500 MHz)δ:7.62(1H，s，H-2')，7.52(1H，d，J=8.0 Hz，H-6')，6.77(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，6.27(1H，s，H-8)，6.07(1H，s，H-6)。13C-NMR(MeOH-d4，500 MHz)δ:177.5(C-4)，165.7(C-7)，162.7(C-5)，158.4(C-9)，148.9(C-4')，148.1(C-2)，146.4(C-3')，137.4(C-3)，124.3(C-1')，121.8(C-6')，116.3(C-5')，116.1(C-2')，104.6(C-10)，99.4(C-6)，94.5(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］對(duì)照一致，鑒定為槲皮素。

化合物4:黃綠色粉末，Molish反應(yīng)呈陽性，ESI-MS m/z:463［M-H］－，487［M+Na］+，301［M-162-1］－，分子式C21H20O12。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:7.60(2H，s，H-2'，H-6')，6.81(1H，d，J=8.5 Hz，H-5')，6.38(1H，s，H-8)，6.17(1H，s，H-6)，5.33(1H，d，J=7.5 Hz，H-1')。13C-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:178.3(C-4)，164.9(C-7)，161.9(C-5)，157.2(C-9)，157.2(C-2)，149.0(C-4')，145.2(C-3')，134.4(C-3)，122.5(C-1')，122.0(C-6')，116.7(C-5')，115.7(C-2')，104.7(C-10)，103.0(C-1″)，99.2(C-6)，94.1(C-8)，76.5(C-5″)，73.9(C-3″)，72.0(C-2″)，68.7(C-4″)，60.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］對(duì)照一致，鑒定化合物為金絲桃苷。

化合物5:白色粉末，ESI-MS m/z:787［M+Na］+，763［M-H］－，碎片峰631［M-132-1］－，分子式C41H64O13。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.82，1.00，1.00，1.00，1.04，1.32，1.36(each 3H，s，7×CH3)，3.32(H-3)，4.92(1H，H-1 of Glc)，5.28(1H，H-1 of Xyl)，5.50(H-12)。13CNMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.3(C-5)，19.0(C-6)，48.5(C-9)，47.2(C-17)，47.0(C-19)，42.7(C-14)，42.5(C-18)，40.3(C-8)，40.0(C-4)，37.5(C-10)，34.8(C-21)，33.8(C-7)，33.0(C-22)，31.3(C-20)，26.7(C-2)，28.6(C-15)，28.8(C-23)，27.1(C-27)，24.3(C-30)，24.3(C-11)，24.3(C-16)，16.0(C-25)，17.5(C-24)，18.0(C-26)，89.7(C-3)，123.6(C-12)，145.4(C-13)，180.2(C-28)，Glc 107.0(C-1)，75.0(C-2)，86.3(C-3)，72.1(C-4)，78.5(C-5)，172.8(C-6)，Xyl 106.4(C-1)，75.4(C-2)，77.8(C-3)，71.3(C-4)，67.9(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10-11］對(duì)照一致，鑒定化合物為3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸。

化合物6:黃綠色粉末，ESI-MS m/z:477［MH］－，501［M+Na］+，315［M-162-1］－，分子式為C22H22O12。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.61(1H，s，5-OH)，8.02(1H，s，H-2')，7.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-6')，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，6.44(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.51(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)，3.84(3H，s，3'-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:177.4(C-4)，164.5(C-7)，161.2(C-5)，156.4(C-9)，156.2(C-2)，149.4(C-3')，147.0(C-4')，133.1(C-3)，121.9(C-6')，121.1(C-1')，115.2(C-5')，113.5(C-2')，103.9(C-10)，101.6(C-1″)，98.8(C-6)，93.7(C-8)，75.9(C-2″)，73.1(C-5″)，71.3(C-4″)，67.9(C-3″)，60.3(C-6″)，56.0(3'-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］對(duì)照一致，鑒定化合物為異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷。

化合物7:白色粉末，ESI-MS m/z:949［M+Na］+，925［M-H］－，碎片峰763［M-162-1］－，631［M-162-132-1］－，分子式C47H74O18。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.82，0.90，0.93，1.00，1.10，1.30，1.31(each 3H，s，7×CH3)，3.20(H-3)，5.04(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)，5.39(1H，d，J=7.5 Hz，H-1of Xyl)，5.43(H-12)，6.35(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)。13CNMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.2(C-5)，19.0(C-6)，48.5(C-9)，47.5(C-17)，46.7(C-19)，42.7(C-14)，42.3(C-18)，40.4(C-8)，40.0(C-4)，37.5(C-10)，34.5(C-21)，33.7(C-7)，33.0(C-22)，31.3(C-20)，26.7(C-2)，28.4(C-15)，28.8(C-23)，27.1(C-27)，24.2(C-30)，24.2(C-11)，24.2(C-16)，16.0(C-25)，17.5(C-24)，18.0(C-26)，89.8(C-3)，123.4(C-12)，144.7(C-13)，177.0(C-28)，Glc 107.3(C-1)，75.2(C-2)，87.0(C-3)，72.0(C-4)，78.6(C-5)，172.8(C-6)，Xyl 106.7(C-1)，75.8(C-2)，78.1(C-3)，71.6(C-4)，67.9(C-5)，Glc 96.3(C-1)，74.7(C-2)，79.9(C-3)，71.5(C-4)，80.4(C-5)，62.7(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10-11］對(duì)照一致，鑒定化合物為3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物8:白色粉末，ESI-MS m/z:949［M+Na］+，925［M-H］－，碎片峰793［M-132-1］－，分子式C47H74O18。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.78，0.98，0.98，1.02，1.08，1.26，1.32(each 3H，s，7×CH3)，3.29(H-3)，5.01(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)，5.44(1H，H-1of Xyl)，5.46(H-12)，5.76(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)。13C-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.2(C-5)，18.9(C-6)，48.4(C-9)，47.2(C-17)，46.9(C-19)，42.6(C-14)，42.5(C-18)，40.2(C-8)，41.1(C-4)，37.4(C-10)，34.7(C-21)，33.8(C-7)，33.7(C-22)，31.5(C-20)，26.7(C-2)，28.6(C-15)，28.6(C-23)，27.1(C-27)，24.2(C-30)，24.2(C-11)，24.2(C-16)，15.9(C-25)，17.2(C-24)，17.9(C-26)，90.1(C-3)，123.0(C-12)，145.3(C-13)，180.7(C-28)，Glc 86.3(C-3)，72.1(C-4)，79.1(C-2)，77.9(C-5)，106.0(C-1)，172.5(C-6)，Xyl 105.5(C-1)，75.8(C-2)，79.1(C-3)，71.4(C-4)，67.9(C-5)，Glc 104.3(C-1)，77.0(C-2)，79.0(C-3)，73.0(C-4)，79.7(C-5)，63.8(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10-11］對(duì)照一致，鑒定化合物為3-O-［β-D-吡喃葡萄糖(1→2)β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸。

4 體外抗真菌活性測試

4.1 供試品溶液制備取化合物5、7、8，分別以甲醇溶解，配制成5 mg/mL溶液，備用。

4.2 抗真菌活性測試采用紙片擴(kuò)散法，分別吸取各供試品溶液10、20、40、80 μL于紙敏片(直徑6 mm)上，吹干后貼在白色念珠菌培養(yǎng)基平板上，蓋上陶瓦蓋，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h，測量其抑菌圈直徑。結(jié)果顯示化合物8對(duì)白色念珠菌生長具有明顯抑制作用，其抑菌圈直徑達(dá)分別為8 mm、9 mm、11 mm、16 mm，而化合物5和7基本不顯示抑菌活性。

5 討論

中藥地膚子中含有較為豐富的皂苷類化學(xué)成分，已有化學(xué)研究也多集中于此，本研究首次從該植物中分離得到3個(gè)黃酮類化學(xué)成分，可為開展地膚子非皂苷類生物活性成分的研究提供了一定參考。

地膚子具有清熱利濕、祛風(fēng)止癢之功效，多以復(fù)方中藥用于皮膚瘙癢等癥，現(xiàn)代藥理研究實(shí)驗(yàn)顯示其水煎劑及醇提物對(duì)一些皮膚真菌有一定抑制作用，但其抗真菌活性成分并不明確。皂苷作為地膚子藥材中的主要成分，本研究中對(duì)提取分離得到多個(gè)地膚子皂苷單體成分進(jìn)行初步的體外抗真菌活性測試，結(jié)果顯示其抗真菌活性程度不一，為深入開展地膚子皂苷類化學(xué)成分的抗真菌活性及其構(gòu)效關(guān)系研究提供了一定的參考依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

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