小鼠海馬內(nèi)HDAC2的表達(dá)及其與NMDA受體、PSD-95的共定位

姚志剛，張 玲，劉 羽，黃 瀾，馬春梅，許艷峰，盛樹力，秦 川

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

突觸后致密區(qū)(postsynaptic density，PSD)是指在電鏡下中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)沿突觸后膜胞質(zhì)面分布的一種均勻而致密的帶狀或盤狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)厚約25～50nm，直徑約250～500nm［1］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，人腦中的PSD含有1461種蛋白，包括膜神經(jīng)遞質(zhì)受體(NMDA受體、AMPA受體、mGlut受體等)、信號(hào)蛋白(CaMKII、SynGAP等)、支架蛋白(PSD-95、Homer、Shank等)、細(xì)胞骨架蛋白(tubulin等)、調(diào)節(jié)蛋白及修飾酶類(CaN、PKC、PKA等)等［2，3］。這些蛋白整合在一起形成的蛋白復(fù)合物有利于它們之間的相互作用和活性調(diào)節(jié)，使突觸后信號(hào)快速并特異性地向胞質(zhì)和胞核傳遞以影響蛋白質(zhì)合成、突觸可塑性調(diào)節(jié)和記憶形成。

組蛋白去乙?；?HDACs)能夠介導(dǎo)組蛋白賴氨酸殘基去乙?；?，導(dǎo)致帶正電荷的賴氨酸殘基與帶負(fù)電荷的DNA分子之間的結(jié)合力增強(qiáng)、染色質(zhì)發(fā)生固縮，使啟動(dòng)子不易接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄［4］。目前已知HDACs包含四大類18個(gè)亞型，其中I類中的HDAC2對(duì)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力具有顯著的負(fù)調(diào)控作用，但具體的分子機(jī)制尚未闡明［5］。而且，有關(guān) HDAC2在海馬部位的分布及其與PSD蛋白復(fù)合物是否存在相互作用的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)C57BL/6小鼠海馬內(nèi)HDAC2的分布及其是否與多種PSD蛋白成員具有共表達(dá)關(guān)系進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察和研究，以期為進(jìn)一步探討HDAC2與PSD蛋白復(fù)合物之間的內(nèi)在聯(lián)系及在海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶過程中可能起到的調(diào)控作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡健康雌性C57BL/6小鼠7只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，體重(20±2)g，合格證號(hào)為 SCXK(京)2009-0007。動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫(25℃)動(dòng)物房獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)(IVC-II型，蘇州市蘇杭科技器材有限公司)，光照14h，黑暗10h，自由飲水取食。小鼠脫臼處死后取全腦，入恒冷冰凍切片機(jī)(Leica CM l850，德國(guó))行10μm連續(xù)冠狀面切片，隔3片取1片。切片于4%多聚甲醛溶液固定20m in，再在0.01mol/L PBS中放置30min，最后經(jīng)純乙醇脫水2min，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠抗小鼠 HDAC2多克隆抗體及兔抗小鼠NMDA受體亞單位 1(NR1)多克隆抗體均購(gòu)自Abcam有限公司，兔抗小鼠PSD-95多克隆抗體由首都醫(yī)科大學(xué)北京宣武醫(yī)院多肽合成室提供。超敏型抗小鼠二步法檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒、異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、羅丹明(TRITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、含有DAPI的水溶性封片劑均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色

HDAC2的組化染色按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，HDAC2一抗稀釋比例為1∶50。圖像拍照及分析應(yīng)用ProgRes CCD攝像頭及分析軟件。

1.4 免疫熒光雙標(biāo)染色

冰凍切片經(jīng)20%山羊血清室溫封閉20m in后直接滴加稀釋好的兩個(gè)一抗(不同種屬來源)，HDAC2、NR1、PSD-95的稀釋比例分別為1∶50、1∶100、1∶100，4℃過夜。次日0.01mol/L PBS洗滌后加入混合稀釋的熒光標(biāo)記二抗(稀釋比例均為1∶100)，37℃水浴箱內(nèi)孵育30min(注意避光)，0.01mol/L PBS充分洗滌后用含有DAPI(353nm波長(zhǎng)激發(fā)產(chǎn)生藍(lán)色熒光)的水溶性封片劑封片。陰性對(duì)照分別用正常兔和小鼠血清代替一抗，其余與上述步驟相同。樣品利用激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(Leica TCS-SP5)對(duì)免疫熒光染色切片進(jìn)行分析和拍照，光源分別用488nm和550nm波長(zhǎng)的激光器激發(fā)綠色和紅色熒光，掃描分辨率為1024×1024pixel，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集，數(shù)字成像。

2 結(jié)果

2.1 海馬內(nèi)HDAC2陽(yáng)性神經(jīng)元的分布

HDAC2免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，以胞核著色為主。在小鼠海馬CA1～CA3區(qū)錐體細(xì)胞層和齒狀回顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元胞核內(nèi)，HDAC2均有較高的表達(dá)量；在海馬始層、輻射層、腔隙-分子層、分子層和多形層散在分布著少量的HDAC2陽(yáng)性細(xì)胞；而在海馬槽和海馬傘部位罕有HDAC2陽(yáng)性著色細(xì)胞。

2.2 NR1、PSD-95陽(yáng)性神經(jīng)元在海馬內(nèi)的分布

由FITC綠色熒光基團(tuán)標(biāo)記的NR1以胞膜著色為主，胞質(zhì)淡染。陽(yáng)性染色神經(jīng)元主要集中在海馬CA1～CA3區(qū)錐體細(xì)胞及齒狀回(DG)顆粒細(xì)胞中，始層、輻射層、腔隙-分子層和多形層可見少量散在分布的陽(yáng)性神經(jīng)元(圖1)。PSD-95為胞質(zhì)蛋白，F(xiàn)ITC綠色熒光基團(tuán)標(biāo)記的陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布于各區(qū)錐體細(xì)胞層和齒狀回顆粒細(xì)胞層，此外始層、輻射層、腔隙-分子層和多形層亦有散在表達(dá)(圖2)。但在海馬室床和海馬傘細(xì)胞中均少見有NR1、PSD-95陽(yáng)性染色細(xì)胞分布(圖1，2見彩插1)。

2.3 HDAC2與NR1、PSD-95的共表達(dá)

拍照后的圖像疊加處理發(fā)現(xiàn)，如圖1和2所示，NR1、PSD-95染色陽(yáng)性(綠色)的海馬CA1～CA3區(qū)錐體細(xì)胞層和齒狀回顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元胞核均有HDAC2的表達(dá)(紅色)，且在CA1～CA3區(qū)始層、輻射層和腔隙-分子層亦可見少量散在分布的雙染神經(jīng)元。此外，DAPI復(fù)染細(xì)胞核形成的藍(lán)色區(qū)域與紅色區(qū)域的重疊證實(shí)HDAC2主要表達(dá)于核內(nèi)。

3 討論

海馬屬于邊緣系統(tǒng)，是人類和其他哺乳動(dòng)物大腦的重要組成部分。大量的實(shí)驗(yàn)資料和臨床觀察表明，海馬結(jié)構(gòu)與空間和識(shí)別記憶密切相關(guān)［6］。C57BL/6小鼠常被認(rèn)作是“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系小鼠，可為許多基因工程動(dòng)物提供遺傳背景。最近的研究顯示，C57BL/6小鼠海馬在3月齡后基本發(fā)育成熟［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)選取3月齡C57BL/6小鼠海馬作為研究NMDA受體、PSD-95、HDAC2表達(dá)及共定位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NMDA受體屬于親離子型谷氨酸受體，屬于突觸后致密區(qū)的組成成分之一。NMDA受體與谷氨酸結(jié)合，迫使NMDA受體離子孔道中的鎂離子斥出而打開NMDA受體孔道，Na+與Ca2+內(nèi)流使突觸后神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高，激活多種Ca2+依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如 Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II(CaMKII)，后者激活細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)基因表達(dá)和突觸可塑性的改變。突觸可塑性能夠誘導(dǎo)新神經(jīng)回路的建立，因此被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的基本神經(jīng)機(jī)制［8］。PSD-95是位于突觸后致密區(qū)的一種支架蛋白，屬于膜相關(guān)的鳥苷酸激酶家族。PSD-95能夠形成多聚體與NMDA受體亞單位相結(jié)合并錨定于突觸后的特定部位，并通過與NMDA受體信號(hào)通路中一系列相關(guān)蛋白結(jié)合將信號(hào)分子、調(diào)節(jié)分子和靶蛋白有機(jī)地整合于谷氨酸能突觸結(jié)構(gòu)并形成信號(hào)復(fù)合體，影響突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性［9］。研究表明，在海馬依賴的空間記憶形成過程中，NMDA受體亞單位NR1，NR2A和PSD-95可被招募至突觸膜表面，以增強(qiáng)突觸可塑性過程中突觸傳遞的效能［10］。并且PSD-95還有助于NMDA受體的簇集和錨定［11］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體亞單位NR1和 PSD-95在7只成年小鼠海馬 CA1～CA3區(qū)錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒神經(jīng)元內(nèi)均有廣泛分布，這與已有的報(bào)道相一致［12，13］，表明 PSD蛋白復(fù)合物在海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶過程中起著重要的作用。

近年來，染色質(zhì)重塑對(duì)學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控作用越來越成為研究的熱點(diǎn)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2在7只小鼠海馬CA1～CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞核內(nèi)均有豐富表達(dá)，且與NR1、PSD-95存在明顯共定位現(xiàn)象。Guan等［5］發(fā)現(xiàn)腦內(nèi) HDAC2過表達(dá)時(shí)，小鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度降低、突觸形成減少、CA1區(qū)LTP形成障礙、空間記憶和工作記憶障礙。而HDAC2敲除或給予了HDACs抑制劑的小鼠則表現(xiàn)出了與上述相反的改變。這提示HDAC2對(duì)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶具有負(fù)調(diào)控作用。最近的研究證實(shí)，正常小鼠經(jīng)學(xué)習(xí)記憶行為訓(xùn)練后海馬神經(jīng)元內(nèi)PSD-95、CaMKIIα、CREB等突觸可塑性相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)存在組蛋白H3和/或H4的乙?；揎棳F(xiàn)象［15，16］。因此，推測(cè)在 HDAC2過表達(dá)的小鼠模型中，這些突觸可塑性相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3和/或H4的乙?；较陆狄鹣鄳?yīng)蛋白表達(dá)減少并導(dǎo)致突觸可塑性障礙。相反，在 HDAC2敲除或給予HDACs抑制劑的小鼠腦中，升高的組蛋白乙?；绞筆SD-95、CaMKIIα等突觸可塑性相關(guān)基因表達(dá)增加，最終促進(jìn)突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性。而在野生型小鼠的學(xué)習(xí)記憶過程中，PSD蛋白活化介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了對(duì)HDAC2活性的調(diào)節(jié)。如甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)可結(jié)合于基因啟動(dòng)子區(qū)并募集REST、CoREST和HDAC2等形成復(fù)合物抑制基因的轉(zhuǎn)錄。由NMDA受體激活的信號(hào)通路可活化CaMKII，后者又可進(jìn)入胞核誘導(dǎo)MeCP2磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物不穩(wěn)定性增加而解離，從而促發(fā)基因轉(zhuǎn)錄［17］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠在16月齡時(shí)海馬組蛋白 H3和H4乙?；斤@著降低并且情景恐懼記憶存在缺陷，推測(cè)其HDACs(包括HDAC2)的表達(dá)和/或活性可能有所增高［18］。

目前有關(guān)HDAC2對(duì)學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控機(jī)制尚有諸多問題需要深入研究，例如，HDAC2參與調(diào)控哪些突觸可塑性相關(guān)基因的表達(dá)以及HDAC2的上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的識(shí)別。結(jié)合已有的文獻(xiàn)資料和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從形態(tài)學(xué)角度推測(cè)在學(xué)習(xí)和記憶過程中，PSD蛋白成員可能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響核內(nèi)HDAC2轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物的裝配而促進(jìn)突觸可塑性相關(guān)基因的表達(dá)，并且這一機(jī)制可能又反過來影響PSD蛋白成員的表達(dá)水平，最終導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化以調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶過程。本研究為探討染色質(zhì)修飾在學(xué)習(xí)記憶中的調(diào)節(jié)作用提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，并為以C57BL/6小鼠為遺傳背景、具有認(rèn)知障礙表現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究提供了形態(tài)學(xué)線索。

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