新腸道病毒71型病毒樣顆粒的制備

李曉楠 曹明慧 李培鋒 (遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，沈陽110164)

近年來，手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)的暴發(fā)在亞洲呈上升趨勢［1］，我國手足口病也呈局部暴發(fā)趨勢，2008年5月2日，中國衛(wèi)生部將該病列為丙類傳染病。HFMD是由腸道病毒感染引起的一種病毒性疾病，臨床表現(xiàn)為口腔黏膜、手和足等多部位皰疹，可引起心肌炎、肺水腫和無菌性腦膜炎等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，潛伏期2～7天，患者主要為學(xué)齡前兒童，尤以≤3歲年齡組發(fā)病率最高［2］。引起HFMD 的腸道病毒有 20 多種［3］，主要為小 RNA 病毒屬的柯薩奇 A 組的 4、5、7、9、10、16型，柯薩奇B組的2、3、5型，?？刹《镜哪承┭逍停?］以及新腸道病毒，其中最常見的病原體為新腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯薩奇 A16型(Coxsackie A16，CA16)［5］，感染 CA16 引起的臨床癥狀較溫和，而感染EV71常引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?，7］，嚴(yán)重時(shí)可造成感染者死亡，這給公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重的威脅。

現(xiàn)階段疫苗仍是防控EV71病毒傳播的最有效手段，VLPs疫苗是體外表達(dá)病毒的若干結(jié)構(gòu)蛋白自動組裝成形態(tài)結(jié)構(gòu)上類似于真正病毒的空心顆粒狀物質(zhì)，具有不含病毒核酸，不具有致病性，抗原表位全面等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)其與病毒感染途徑相同并可呈遞給免疫細(xì)胞，可誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效免疫保護(hù)應(yīng)答。因此，探索利用昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子、Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)和蔗糖密度梯度離心等方法制備和純化EV71 VLPs，具有顯著的應(yīng)用價(jià)值，可為EV71手足口疫苗的研究制備提供有力參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及質(zhì)粒 限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司;EV71 VP1鼠抗單克隆抗體購自艾美捷科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG購自北京鼎國生物技術(shù)公司;Wave波浪反應(yīng)器購自Gerneral Electric公司;Cellfection?Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Sf900Ⅲ昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基和pFast-Bac Dual穿梭質(zhì)粒購自Invitrogen公司;熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞 Sf9昆蟲細(xì)胞系購自Invitrogen公司。

1.3 EV71 P1-3CD Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子優(yōu)化并合成 EV71 P1和EV71 3CD，利用 DNAMAN軟件設(shè)計(jì)基因引物，并由Invitrogen公司合成，擴(kuò)增P1和3CD基因的上下游引物如下：P1上游引物：5＇-ATAGCGCGCATGGATCCCAGGTGTCCACTCAG-3＇酶切位點(diǎn)：BssHⅡ;P1下游引物：5'-CGCAAGCTTTTACAGAGTAGTGATAGCAGTTCT-3＇酶切位點(diǎn)：HindⅢ。3CD上游引物：5＇-ACGCTCGA GGGACCTTCCCTGGACTTCGCT-3＇酶切位點(diǎn)：XhoⅠ;3CD 下游引物：5＇-ACGGCATGCCTAGGACCTTCCCTGGACTTCGCT-3＇酶切位點(diǎn)：SphⅠ。

1.3.2 EV71 P1-3CD Bacmid重組 將擴(kuò)增的EV71 P1和3CD片段連接到FastBac Dual載體多角體蛋白啟動子pPh和pP10上，構(gòu)建重組pFastBac Dual EV71 P1-3CD質(zhì)粒，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化DH10 BacTME．coli感受態(tài)細(xì)胞，與Bacmid發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，培養(yǎng)72小時(shí)后，利用通用引物M13-M4/RV對所獲得的EV71 P1-3CD Bacmid DNA重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.4 EV71 P1-3CD Bacmid DNA重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及鑒定

1.4.1 重組質(zhì)粒EV71 P1-3CD Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9 按Bac-to-Bac?Baculovirus Expression System Cellfection?Reagent(Invitrogen)操作說明書，將EV71 P1-3CD Bacmid DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9，72小時(shí)收集細(xì)胞上清，觀察昆蟲細(xì)胞Sf9病變。

1.4.2 重組EV71 P1-3CD桿狀病毒DNA PCR鑒定應(yīng)用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取桿狀病毒的DNA，利用P1和3CD基因的上下游引物擴(kuò)增P1、3CD片段，并測序。1.4.3 間接免疫熒光檢測(IFA) EV71 P1-3CD Bacmid DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9 72小時(shí)后，吹散Sf9細(xì)胞，1 000 r/min離心5分鐘，用3%多聚甲醛固定，PBS洗 2次，10%FBS封閉，3%BSA稀釋EV71-VP1鼠抗單克隆一抗，室溫孵育1小時(shí);PBS洗3次，再加入1∶200稀釋FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃作用45分鐘，PBS洗3次，晾干載玻片，加入緩沖甘油，蓋上蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察。

1.4.4 Bac-EV71 P1-3CD病毒毒力的測定 6孔板每孔加入2 ml細(xì)胞懸液，Sf-900ⅢSFM將病毒液做10倍系列稀釋(10-3～10-8);棄去6孔板Sf9細(xì)胞上清，取系列稀釋病毒各1 ml分別加入到對應(yīng)每孔內(nèi)，對照孔加入新鮮培養(yǎng)基;細(xì)胞與病毒液27℃作用1小時(shí);當(dāng)細(xì)胞與病毒液27℃作用第二個(gè)1小時(shí)后，移去病毒液，每孔加入2 ml空斑覆蓋液;27℃培養(yǎng)細(xì)胞7～10天，每天觀察6孔板直至空斑計(jì)數(shù)易于辨認(rèn)并連續(xù)兩天不變，每一孔最佳計(jì)數(shù)范圍為3～9個(gè)空斑測定接種效價(jià)。用下述公式計(jì)算效價(jià)(pfu/ml)：pfu/ml(原始母株)=1/稀釋倍數(shù)×空斑數(shù)×1/(接種量ml/平板)。

1.5 EV71 VLPs的純化及鑒定

1.5.1 蔗糖密度梯度離心純化EV71 VLPs 收集桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞，-80℃反復(fù)凍融3次，6 000 r/min離心20分鐘，上清經(jīng)孔徑為30 kD膜包濃縮。超速離心機(jī)再次進(jìn)行濃縮，濃縮產(chǎn)物通過蔗糖密度梯度離心純化，蔗糖密度依次為15%、30%和45%，每個(gè)蔗糖密度各 3 ml，VLPs上樣 3 ml，27 000 r/min，4℃離心過夜，15%與30%蔗糖層出現(xiàn)蛋白帶，收取蛋白混合物500 μl。

1.5.2 SDS-PAGE及Western blot免疫印跡法檢測目的蛋白表達(dá) 純化EV71 VLPs分別行SDS-PAGE和Western blot鑒定，檢測按常規(guī)方法進(jìn)行，樣品跑SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色;同時(shí)將PAGE膠上相應(yīng)分子量處的目的蛋白轉(zhuǎn)于硝酸纖維膜上，用脫脂奶封閉37℃1小時(shí)，一抗(1∶3 000)4℃封閉過夜;次日再用HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶25 000)封閉37℃1小時(shí)，最后用DAB顯色系統(tǒng)顯色。

1.5.3 透射電鏡觀察 Bac-EV71 P1-3CD桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞(1×107)12 000 r/min，10分鐘，棄上清，4℃固定液固定1小時(shí)，PBS洗2次，每次5分鐘，4℃ 1%鋨酸固定2小時(shí)，丙酮脫水，每次3分鐘，丙酮：Epon812(1∶1)混合包埋室溫浸泡30分鐘，Epon812包埋37℃ 12小時(shí)，60℃聚合48小時(shí)，超薄切片機(jī)切片，放置銅網(wǎng)上，進(jìn)行1%醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙染色，沖洗后干燥，利用透射電鏡上觀察昆蟲細(xì)胞內(nèi)重組桿狀病毒及EV71 VLPs形態(tài)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 EV71 P1-3CD的P1和3CD基因PCR鑒定EV71 P1-3CD的P1和3CD基因經(jīng)PCR后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增片段的大小分別為2 586 bp和1 935 bp(圖1)，與合成EV71 P1和EV71 3CD基因大小相符。

2.2 EV71 P1-3CD BacmidDNA重組質(zhì)粒PCR鑒定及電泳 將重組pFastBac Dual-EV71 P1-3CD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有Bacmid及輔助質(zhì)粒的DH10感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，通用引物M13 M4/RV對其菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性質(zhì)粒約7 081 bp(圖2)，大小與預(yù)期結(jié)果一致，說明EV71 P1-3CD基因成功轉(zhuǎn)座到Bacmid。

2.3 EV71 P1-3CD Bacmid DNA電泳 按Invitrogen公司 PureLinkTMHiPure Plasmid Midiprep Kit產(chǎn)品說明書提取EV71 P1-3CD Bacmid DNA，經(jīng)0.5%瓊脂糖電泳鑒定，由圖3可見，片段大小與預(yù)期的一致，這進(jìn)一步證實(shí)pFastBac Dual-EV71 P1-3CD與Bacmid成功同源重組。

2.4 EV71 P1-3CD Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9

圖1 EV71 P1和EV71 3CD基因PCR鑒定圖Fig．1 Identified target genes of EV71 P1 and EV71 3CD by PCR

按照 Bac-to-Bac?Baculovirus Expression System Cellfection?Reagent(Invitrogen)的說明書，EV71 P1-3CD Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，由圖4可見，轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞Sf9變大，折光性增強(qiáng)，貼壁能力差，細(xì)胞間隙大，感染96小時(shí)，細(xì)胞有少量溶解破碎。

圖2 重組EV71 P1-3CD Bacmid DNA鑒定圖Fig．2 Identification of recombinant pFastBac Dual-EV71 P1-3CD Bacmid DNA

圖3 重組EV71 P1-3CD桿粒DNA電泳鑒定圖Fig．3 Analysis of recombinant EV71 P1-3CD Bacmid DNA by agarose gel electrophoresis

圖4 重組EV71 P1-3CD桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞Sf9病變圖(×200)Fig．4 CPE of the Sf9 cells infected by recombinant EV71 P1-3CD Baculovirus( ×200)

2.5 重組EV71 P1-3CD桿狀病毒DNA PCR鑒定

將盲傳4代的EV71 P1-3CD桿狀病毒提取DNA，分別利用特異引物及通用引物進(jìn)行PCR鑒定，特異引物鑒定，可見約在1 935及2 586 bp處有特異性條帶，大小與合成基因大小相符，通用引物鑒定在7 081 bp處有條帶(圖5)，與預(yù)期目的大小也一致，證明桿狀病毒為EV71 P1-3CD桿狀病毒。

圖5 傳4代重組EV71 P1-3CD桿狀病毒基因組PCR鑒定圖Fig．5 Identification of recombinant EV71 P1-3CD Baculovirus genome DNA after 4 blind passages

圖6 昆蟲細(xì)胞Sf9表達(dá)EV71 P1-3CD蛋白的間接免疫熒光檢測Fig．6 Indirect immunofluorescence analysis of recombinant EV71 P1-3CD protein in Sf9 cells

2.6 IFA檢測重組EV71 P1-3CD蛋白 將感染EV71 P1-3CD桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞Sf9，經(jīng)3%多聚甲醛固定后，利用EV71 VP1鼠抗單克隆抗體和熒光標(biāo)記二抗進(jìn)行IFA檢測，VLPs蛋白可以與單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，其感染細(xì)胞可檢測到FITC熒光，而空白Sf9細(xì)胞無FITC信號(圖6)，證明VLPs蛋白成功表達(dá)。

2.7 重組EV71 P1-3CD桿狀病毒空斑試驗(yàn) EV71 P1-3CD桿狀病毒做空斑試驗(yàn)，經(jīng)肉眼觀察，重組EV71 P1-3CD桿狀病毒產(chǎn)生很淡的牛奶灰色空斑(圖7)，經(jīng)計(jì)算重組EV71 P1-3CD桿狀病毒原始母株效價(jià)約為2×106pfu/ml。

2.8 EV71 VLPs純化 收集感染EV71 P1-3CD桿狀病毒的Sf9細(xì)胞，-80℃反復(fù)凍融3次，超速離心濃縮，由圖8可見，在15%與30%蔗糖層出現(xiàn)一條分離帶，回收分離帶。

圖7 重組EV71 P1-3CD桿狀病毒空斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig．7 Viral plaque assay of recombinant EV71 P1-3CD

圖8 蔗糖密度梯度離心法純化重組EV71 VLPsFig．8 Sucrose density gradient centrifugation purification of EV71 VLPs

2.9 EV71 VLPs的SDS-PAGE分析及Western blot檢測 回收15%與30%蔗糖之間分離帶并用PBS脫糖2次，12.5%SDS-PAGE電泳，由圖9可以清晰看到 VP0(約39 kD)、VP1(約34 kD)和 VP3(約27 kD)，經(jīng)Western blot檢測有VP1特異條帶。

圖9 SDS-PAGE分析及Western blot檢測EV71 VLPsFig．9 SDS-PAGE analysis and Western blot detection of recombinant EV71 VLPs

圖10 純化EV71 VLPs電鏡觀察Fig．10 Electron micrograph of purified EV71 VLPs

2.10 透射電鏡觀察EV71 VLPs 利用透射電鏡觀察純化EV71 VLPs，由圖10可見，病毒樣顆粒分布均勻，形狀規(guī)則，測定病毒樣顆粒直徑約為23～33 nm，形態(tài)和大小與腸道病毒EV71一致。

3 討論

HFMD作為國家丙類傳染病，在全國各地引起多次暴發(fā)，累及地域廣、患病人口多，受到人們廣泛關(guān)注。EV71是手足口病的主要病原，病人感染EV71易出現(xiàn)麻痹、無菌性腦膜炎和腦膜腦炎等并發(fā)癥［8，9］。自 1998 年臺灣地區(qū) HFMD 大流行以來，EV71疫苗的研究受到廣泛關(guān)注，但到目前為止有關(guān)疫苗的研究均處于一期臨床或臨床前研究階段。VLPs疫苗在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然病毒顆粒相似，它作為免疫原保留全面的抗原表位，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性，產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)比滅活全病毒疫苗更全面［10］，并且不含有病毒遺傳物質(zhì)，不具感染性，不發(fā)生基因恢復(fù)性突變重組，安全性方面優(yōu)于滅活和減毒病毒疫苗，因此，成為近年來的研究熱點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道利用Bac-to-Bac表達(dá)的HPV VLPs已進(jìn)入臨床研究，輪狀病毒和細(xì)小病毒等VLPs進(jìn)入臨床前研究，這些表明VLPs疫苗發(fā)展前景廣闊［11］。本實(shí)驗(yàn)首先經(jīng)昆蟲密碼子優(yōu)化的EV71 P1和EV71 3CD基因，后期對病毒空斑試驗(yàn)和感染收獲時(shí)間等方面均進(jìn)行優(yōu)化，提高EV71 VLPs的表達(dá)量。目前VLPs純化的方法有：蔗糖密度梯度離心、CsCl密度梯度離心、分子篩、磁珠純化和凝膠層析技術(shù)純化等。CsCl密度梯度離心純化的純度較高，但其會破壞病毒的構(gòu)象且后期需要將VLPs中的CsCl除去，對純化VLPs損失較大;分子篩純化需要較多體積的病毒濃縮液，凝膠層析技術(shù)純化分離操作較慢，有時(shí)還有非特異吸附現(xiàn)象;蔗糖密度梯度離心法根據(jù)沉降系數(shù)不同而達(dá)到分離純化目的，優(yōu)點(diǎn)在于樣品回收率較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用蔗糖密度梯度離心純化VLPs可行的，對VLPs形成破壞性較小，且能較好的保護(hù)病毒顆粒的形態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)成功制備了EV71 VLPs，并利用蛋白濃度檢測BCA法檢測EV71 VLPs表達(dá)量為0.817 mg/ml，高效液相色譜法檢測純度大于90%。Chung等［12］已用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EV71 P1和3CD蛋白，利用3CD將P1切割VP1、VP3和 VP0三個(gè)蛋白并裝配成EV71 VLPs，這于本文結(jié)果一致，Chung等［13］進(jìn)一步利用EV71 VLPs免疫小鼠可誘發(fā)Th1/Th2免疫應(yīng)答，免疫母鼠后攻擊新生鼠可產(chǎn)生保護(hù)作用。Chung等［14］利用 CMV和 IE-1啟動子構(gòu)建Bac-P1-C3CD和Bac-P1-I3CD，經(jīng)過宿主細(xì)胞，細(xì)胞密度，培養(yǎng)模式和溶解氧(DO)等方面優(yōu)化有效提高了VLPs的表達(dá)量，為64.3 mg/L，比傳統(tǒng)方法提高了約43倍，而且在小鼠模型產(chǎn)生的抗體能較好的中和EV71型同源和異源毒株，比本文的表達(dá)量高出約78倍，這為本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究獲得較高純度、濃度和形態(tài)完整的VLPs和進(jìn)行免疫學(xué)評價(jià)提供了借鑒依據(jù)。

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