ODDD乏氧靶向HSV1-TK/GCV系統(tǒng)對體外肝癌細(xì)胞的殺傷作用①

方艷秋 劉 磊 譚 巖 蔣永興 (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長春130021)

靶向基因治療被認(rèn)為是一種有效的肝癌治療研究手段［1］。瘤體組織內(nèi)的乏氧改變，為肝癌基因治療提供了理想靶點(diǎn)。位于HIF-1α(Hypoxia inducible factor-1 alpha)分子中有一段含有200多個(gè)氨基酸殘基的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(Oxygen dependent degradation domain，ODDD)可以有效的感受組織環(huán)境中的氧含量，調(diào)控與之相連的蛋白乏氧靶向性特異表達(dá)［2］。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建含有ODDD序列的單純皰疹病毒胸苷激酶(Herpeslsimplex virus-thymidine kinase，HSV1-TK)自殺基因表達(dá)載體，體外研究其對肝癌細(xì)胞株SMMC7721和HepG2的殺傷作用，探討ODDD調(diào)控HSV1-TK基因乏氧靶向治療肝癌的可行性。

1 材料與方法

1.1儀器和實(shí)驗(yàn)材料 肝癌細(xì)胞株SMMC7721、HepG2由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng);質(zhì)粒pEGFP-ODDD為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。攜帶HSV1-TK的質(zhì)粒pHSV106為Gibco/BRL公司產(chǎn)品。二甲亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(MTT液)為Sigma公司產(chǎn)品。250 mg MTT溶于50 ml PBS(0.01 mol/L，pH7.4)中，0.22 μm微孔濾器除菌，分裝，4℃保存。更昔洛韋(GCV)，分子量為255，美國 Sigma公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1pEGFP-TK和pEGFP-TK-ODDD表達(dá)載體的構(gòu)建 參照本研究組前期工作［3］。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞

將處于對數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分別接種于24孔板，接種數(shù)量為5×104/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后待細(xì)胞90%融合時(shí)用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染pEGFP-TK和pEGFP-TK-ODDD質(zhì)粒。流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞48小時(shí)EGFP表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.3MTT法檢測HSV1-TK/GCV系統(tǒng)對肝癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4小時(shí)將培養(yǎng)液換為含10%血清的IMDM培養(yǎng)液。細(xì)胞分為6組：A.常氧未轉(zhuǎn)染組;B.常氧轉(zhuǎn)染pEGFP-TK組;C.常氧轉(zhuǎn)染pEGFP-TK-ODDD組;D.乏氧未轉(zhuǎn)染組;E.乏氧轉(zhuǎn)染pEGFP-TK組;F.乏氧轉(zhuǎn)染pEGFP-TK-ODDD組。與實(shí)驗(yàn)各組平行設(shè)立只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞作為空白對照，每組又分為不同GCV濃度亞組(mg/L)：0、12.5、25、50、100、200 和 400。更換培養(yǎng)液后 D 組、F組、E組放入乏氧環(huán)境中(三氣培養(yǎng)箱含1%O2，5%CO2和N2平衡氣)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后將原培養(yǎng)液棄去，加入含有不同濃度GCV的完全培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以不加GCV的細(xì)胞作為陰性對照。24小時(shí)后換為不含GCV的完全培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時(shí)后加入 200 μl/孔 MTT 液(300 μl/ml)，溫浴4小時(shí)后，棄上清，每孔加入DMSO 200 μl，作用30分鐘并輕微振蕩后，使結(jié)晶物充分溶解。將100 μl上清液加入到96孔培養(yǎng)板中，空白對照調(diào)零，于波長540 nm酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率(%)=(處理組平均A值/陰性對照組A值)×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)采用方差分析，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1自殺基因載體細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 1 μl Lipofectam ineTM2000分別和4 μg pEGFP-TK-ODDD質(zhì)?；旌虾筠D(zhuǎn)染SMMC7721和HepG2細(xì)胞48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測 EGFP表達(dá)。結(jié)果顯示：根據(jù)對SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞EGFP表達(dá)量分析，細(xì)胞pEGFP-TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率分別為33.23%和36.97%，見圖1。

2.2腫瘤細(xì)胞對前體藥物GCV敏感性 應(yīng)用不同濃度GCV加入培養(yǎng)相同細(xì)胞數(shù)目的未轉(zhuǎn)染的SMMC7721和 HepG2細(xì)胞作用24小時(shí)后，經(jīng)過MTT方法檢測，SMMC7721和HepG2細(xì)胞在常氧及乏氧環(huán)境下各組吸光值(如表1)。應(yīng)用公式計(jì)算獲得細(xì)胞的生存率，發(fā)現(xiàn)在GCV＜50 mg/L時(shí)，GCV對未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無殺傷作用，不會產(chǎn)生對系統(tǒng)的毒性作用。隨著GCV濃度增大，細(xì)胞存活率逐漸下降，GCV＞100 mg/L時(shí)，GCV對細(xì)胞有毒性作用(P＜0.05)，這種毒性作用與環(huán)境中的氧濃度無關(guān)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測質(zhì)粒pEGFP-TK細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率Fig．1 Flow cytometric analysis for transfection rate of pEGFP-TK in cells

表1 GCV對腫瘤細(xì)胞增殖的影響(n=3)Tab．1 The sensitivity of cells to GCV(n=3)

圖2 HSV1-TK/GCV對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-TK細(xì)胞的殺傷作用(n=3)Fig．2 The effect of GCV on growth of SMMC7721 cells and HepG2 cells transfected by the plasmid of pEGFP-TK(n=3)

2.3GCV對轉(zhuǎn)染pEGFP-TK質(zhì)粒腫瘤細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng) 轉(zhuǎn)染pEGFP-TK質(zhì)粒后，隨著GCV濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，細(xì)胞對GCV的敏感性呈劑量依賴性(P＜0.05，圖2)。在相同GCV濃度，乏氧時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率高于常氧時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，提示乏氧可能降低腫瘤細(xì)胞對GCV代謝物的敏感性，但對于HSV1-TK/GCV對腫瘤的殺傷作用影響不顯著。

2.4ODDD調(diào)節(jié)HSV1-TK/GCV對乏氧腫瘤細(xì)胞的靶向性殺傷作用 GCV處理轉(zhuǎn)染pEGFP-TKODDD細(xì)胞24小時(shí)后，無論是SMMC7721細(xì)胞還是HepG2細(xì)胞，乏氧組細(xì)胞存活率較常氧組對照均顯著下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，各組均P＜0.05(圖3)。提示ODDD結(jié)構(gòu)域能感受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的變化，正常氧環(huán)境下使TK蛋白降解，從而減少對GCV的催化作用，降低了對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用;而在乏氧組，TK蛋白可以穩(wěn)定存在發(fā)揮生物活性，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活率隨著GCV濃度的升高而逐漸降低。

3 討論

乏氧是實(shí)體腫瘤發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象，影響腫瘤細(xì)胞的很多基因轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變。肝癌細(xì)胞組織內(nèi)缺氧尤為顯著，肝內(nèi)正常的血供系統(tǒng)的破壞和肝臟腫瘤細(xì)胞的高度增殖是引起肝癌組織內(nèi)嚴(yán)重缺氧的重要原因［4］。肝癌微環(huán)境的乏氧是導(dǎo)致肝癌化療耐藥的重要原因，多年來人們一直在研究克服腫瘤乏氧的方法，各種療法雖然在不同程度上改善了腫瘤的乏氧現(xiàn)象，但都未能在臨床中得到廣泛的應(yīng)用?；蛑委煴徽J(rèn)為是最有前景的腫瘤治療方法，從1989年開始應(yīng)用于臨床至今已經(jīng)有超過200多個(gè)有關(guān)腫瘤基因治療的臨床試驗(yàn)［5］。靶向性一直是基因治療領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，載體的不專一不但降低了靶基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，同時(shí)還可能會誤殺非靶器官或腫瘤以外部位，造成副作用［6］。

圖3 GCV對轉(zhuǎn)染pEGFP-TK-ODDD質(zhì)粒腫瘤細(xì)胞增殖的影響(n=3)Fig．3 The effect of GCV on growth of SMMC7721 cells and HepG2 cells transfected by the plasmid of pEGFP-TK-ODDD(n=3)

以HSV1-TK/GCV系統(tǒng)為代表的自殺基因療法可以實(shí)現(xiàn)選擇性原位轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性殺傷的優(yōu)點(diǎn)，從而使其較早獲得美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)和重組DNA顧問委員會(RAC)的批準(zhǔn)而應(yīng)用于臨床［6］。本研究選用了兩種研究中比較常見的肝癌細(xì)胞株SMMC7721和HepG2作為靶細(xì)胞來探討HSV1-TK/GCV系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染效率基本相同的情況下，GCV濃度為12.5 mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)染 pEGFP-TK質(zhì)粒的 SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率為64.21%和57.41%，均低于未轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的存活率，說明轉(zhuǎn)染了pEGFP-TK質(zhì)粒的細(xì)胞能夠有效的將前體藥物GCV轉(zhuǎn)換為對細(xì)胞有毒性的藥物，發(fā)揮對肝癌細(xì)胞株SMMC7721和HepG2的殺傷作用，HSV1-TK/GCV系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用具有普遍性。

目前限制自殺基因療法臨床應(yīng)用主要原因之一是高劑量的GCV對機(jī)體可能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)GCV濃度大于1 mmol/L即可產(chǎn)生對細(xì)胞毒性作用［7］。本研究也證實(shí)，在乏氧及正常氧環(huán)境下，低濃度GCV(＜50 mg/L)對SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率無明顯影響，細(xì)胞存活率幾乎為100%;隨著GCV濃度增大，細(xì)胞存活率下降，在GCV濃度400 mg/L時(shí)，細(xì)胞的存活率降到70%左右(SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率分別68.46%和71.35%)，說明高濃度GCV(＞100 mg/L)時(shí)在常氧和乏氧環(huán)境下均可以產(chǎn)生對細(xì)胞的毒性作用，可能會在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生對系統(tǒng)的非靶向性傷害。

以乏氧為靶點(diǎn)的腫瘤基因療法被證實(shí)可以有效的發(fā)揮殺傷腫瘤的同時(shí)，還可以顯著的降低基因疫苗對機(jī)體的損傷毒性作用［8，9］。ODDD是調(diào)控HIF-1α分子在乏氧環(huán)境中特異性發(fā)揮生物學(xué)活性的重要結(jié)構(gòu)域，研究進(jìn)一步證實(shí)含有ODDD結(jié)構(gòu)域的重組蛋白可以在乏氧環(huán)境下特異的表達(dá)并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［10］。本研究的目的就是將ODDD結(jié)構(gòu)域?qū)Ψρ醯奶禺愋詰?yīng)答效應(yīng)應(yīng)用到調(diào)控HSV1-TK/GCV系統(tǒng)中，利用腫瘤乏氧的特異性病理改變使TK基因在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)，靶向殺傷肝癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染含有相同濃度GCV作用后，乏氧環(huán)境下SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率顯著低于正常氧環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞(見結(jié)果2.4，P＜0.05)。提示乏氧環(huán)境下細(xì)胞中的HSV1-TK基因可以穩(wěn)定表達(dá)發(fā)揮對前體藥物GCV的催化作用，使其轉(zhuǎn)化為對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用的藥物。而在正常氧環(huán)境下，ODDD可以感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧水平，誘導(dǎo)HSV1-TK蛋白特異性的降解，使其不能有效發(fā)揮其生物效應(yīng)，ODDD介導(dǎo)的自殺基因靶向性殺傷研究為肝癌的基因治療研究提供了新的研究方法。

1 Sangro B，Prieto J.Gene therapy for liver cancer：clinical experience and future prospects［J］.Curr Opin Mol Ther，2010;12(5)：561-569.

2 Min J H，Yang H，Ivan M et al.Structure of an HIF-1alpha-pVHL complex：hydroxyproline recognition in signaling ［J］.Science，2002;296(5574)：1886-1889.

3 劉 磊，方艷秋，許淑芬et al.ODDD調(diào)節(jié)HSV-HSV1-TK/GCV對乏氧環(huán)境宮頸癌Hela細(xì)胞特異殺傷傷作用的研究［J］.中國婦幼保健，2008;23(9)：1278-1281

4 Yang J D，Nakamura I，Roberts L R.The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma：current status and therapeutic targets［J］.Semin Cancer Biol，2011;21(1)：35-43.

5 Edelstein M L，Abedi M R，Wixon J.Gene therapy clinical trials worldwide to 2007-an update［J］.J Gene Med，2007;9(10)：833-842.

6 Greco O，F(xiàn)olkes L K，Wardman P et al.Development of a novel enzyme prodrug combination for gene therapy of cancer：horseradish peroxidase/indole-3-acetic acid［J］.Cancer Gene Ther，2000;7(11)：1414-1420.

7 Heo D S.Progress and limitations in cancer gene therapy［J］.Genet Med，2002;4(6 Suppl)：52s-55s.

8 Marukawa Y，Nakamoto Y，Kakinoki K et al．Membrane-bound form of monocyte chemoattractant protein-1 enhances antitumor effects of suicide gene therapy in a model of hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Gene Ther，2012;19(5)：312-319.

9 李 玲，邢力剛，于金明.腫瘤乏氧靶向基因治療研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊，2004;5(31)：352-355.

10 Harada H，Hiraoka M，Kizaka-Kondoh S.Antitumor effect of TAT-oxygen-dependent degradation-caspase-3 fusion protein specifically stabilized and activated in hypoxic tumor cells［J］.Cancer Res，2002;62(7)：2013-2018.