乳腺（癌）干細胞與Wnt信號通路

陳旭東

（復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院 分子醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，上海 200032)

腫瘤的起源目前有體細胞學(xué)說和干細胞學(xué)說。如果說宇宙起源于大爆炸，那腫瘤則是細胞在人體里的大爆炸。惡性腫瘤是來自干細胞的大爆炸而良性腫瘤是來自體細胞的大爆炸，因為致腫瘤因子既要改變與“增殖”相關(guān)的基因或基因組，又要改變與“分化”相關(guān)的基因或基因組，而干細胞具有自主分化的功能，無需改變。本綜述以乳腺癌為例，介紹目前惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究熱點和方向，著重說明干細胞的研究現(xiàn)狀。

1 乳腺(癌)干細胞

正常乳腺組織由乳腺干細胞分化而來。而腫瘤的干細胞假說則認為乳腺癌來源于分化不同階段的乳腺干/前體細胞的突變，這對乳腺癌的異質(zhì)性是很好的解釋。由于以前缺乏特異的分子表面標記和體外培養(yǎng)系統(tǒng)以維持干細胞的未分化狀態(tài)，乳腺（癌）干細胞的分離和培養(yǎng)受到制約。Al-Hajj等[1]成功鑒定了乳腺癌干細胞為CD44+CD24-Lin-的細胞亞群。參照胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法，目前已成功分離和培養(yǎng)乳腺干細胞：以“mammospheres”（乳腺細胞團）的形式，懸浮生長在無血清培養(yǎng)基上。并證實富含自我更新能力和分化成乳腺組織的三種細胞系（導(dǎo)管上皮、肌上皮、腺泡上皮）的未分化細胞?！癿ammospheres”亦含有ER+增殖前體細胞。若將“mammospheres”的細胞與成纖維細胞混合，在NOD/SCID小鼠的清潔乳腺脂肪墊上，可重建具有導(dǎo)管腺泡結(jié)構(gòu)的正常乳腺組織[2-4]。依照同樣方法成功分離和培養(yǎng)了乳腺癌細胞系MCF-7及臨床標本的乳腺癌干/前體細胞[5]。基因表達譜分析提示，“mammospheres”與血液、神經(jīng)及胚胎干細胞有顯著的重疊。影響干細胞自我更新的信號通路有Notch、Hedgehog、側(cè)翼蛋白（Wnt）、LIF等，前三者亦參與細胞命運的決定。正常干細胞與腫瘤干細胞共享某些特征：自我更新能力、端粒酶表達、分化能力、抗凋亡及特異位點的宿駐。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)可能與腫瘤干細胞有關(guān)，因此，腫瘤干細胞的研究成為熱點。

2 Wnt信號通路

由Wnt介導(dǎo)的信號通路在進化上高度保守，已知Wnt通路與細胞命運的決定、細胞增殖、細胞形態(tài)、遷移、凋亡、分化及干細胞自我更新有關(guān)[8]。Wnt信號通路包括經(jīng)典的Wnt-β-catenin途徑和非經(jīng)典途徑。前者通過Wnt蛋白與膜受體frizzled結(jié)合，通過β 鏈蛋白導(dǎo)致下游基因的轉(zhuǎn)錄激活。無Wnt信號，β-catenin滯留在胞漿，與抑癌基因APC（adenomatous polyposis coli）、axin及糖原合成酶激酶3（GSK3）形成復(fù)合物。GSK3能磷酸化β-catenin，啟動β-catenin的泛素化降解途徑。Wnt信號激活，GSK3抑制，阻礙了β-catenin的磷酸化，非磷酸化的β-catenin是穩(wěn)定的，且能入核結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF，導(dǎo)致下游基因（c-Myc、cyclin D1等）的轉(zhuǎn)錄激活[6-7]。因此，非磷酸化的、游離的β鏈蛋白是Wnt信號通路下傳的中心環(huán)節(jié)。β鏈蛋白尚與E-cadherin（一個重要的細胞黏附分子）的胞內(nèi)段結(jié)合。非經(jīng)典途徑可能通過如下三種機制：Wnt/Ca2+通路、Wnt/G蛋白通路和Wnt/PCP通路[9]（見圖1）。目前研究較多的是Wnt信號的經(jīng)典途徑。

圖1 Wnt信號的經(jīng)典途徑 (a）與非經(jīng)典途徑（b）

3 乳腺(癌)干細胞與Wnt信號通路

Wnt基因家族成員的wnt-1、wnt-3和wnt-10b都是由小鼠乳腺乳頭狀病毒（MMTV）誘發(fā)小鼠乳腺癌的過程中活化的癌基因。小鼠wnt-1、wnt-2、wnt-3a、wnt-5a與wnt-7基因在體外均具有轉(zhuǎn)化細胞的能力。目前雖無明確證據(jù)表明，Wnt基因異常能直接導(dǎo)致人類腫瘤的發(fā)生，但是Wnt-5a在乳腺癌及早期乳腺增生中過度表達更為明顯，因此Wnt-5a具有癌基因的某些特性。 研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中免疫組化檢測到核或胞質(zhì)β-catenin水平增高；E-cadherin啟動子區(qū)被高度甲基化，低表達或失活的E-cadherin能使與膜結(jié)合β-catenin減少，導(dǎo)致胞內(nèi)游離的β-catenin量增加，從而激活Wnt信號通路，使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此，可以認為E-cadherin具有抑癌基因的功能[10]。抑癌基因APC與結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)系極為密切。結(jié)腸癌細胞中APC的失活可直接導(dǎo)致β-catenin在核內(nèi)的累積；或β-catenin點突變抑制β-catenin蛋白磷酸化，不能降解，造成Tcf-4靶基因活化[11]。而在乳腺癌中均未發(fā)現(xiàn)APC的失活或β-catenin點突變。Wnt通路通過對乳腺生長發(fā)育的幾個階段產(chǎn)生影響，可能跟授乳期后的乳腺復(fù)舊有關(guān)。最近研究表明，在乳腺癌中，某些Wnt信號通路中的特異蛋白質(zhì)的過表達或下調(diào)；如CKII及sFRP4的過表達及WIF-1和sFRP-1的下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)DVL-1的擴增[8]。通過細胞外給予Wnt拮抗劑FRP1及DKK1引起乳腺癌β-catenin水平下調(diào)，伴隨著細胞分化特征的改變[12]。更進一步的研究著眼于Wnt信號通路如何在不同組織類型的乳腺癌的發(fā)生，發(fā)展中起作用，以及是否促進乳腺（癌）干細胞的自我更新。

Wnt1是首個被克隆的小鼠原癌基因，其被插入MMTV后具有病毒介導(dǎo)的致癌作用[13]。隨后的MMTV.LTR-Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠亦證實小鼠乳腺小葉腺泡上皮增生，一年內(nèi)100%小鼠產(chǎn)生乳腺腺瘤。MMTV.-Wnt1 轉(zhuǎn)基因小鼠亦成為廣泛應(yīng)用的乳腺腫瘤動物模型[14]。例如以此模型構(gòu)建LRP-5缺失突變體，發(fā)現(xiàn)了LRP-5-/-MMTV.-Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺發(fā)育延遲，產(chǎn)生抗腫瘤的表型[15]；發(fā)現(xiàn)了MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用[16]；以及發(fā)現(xiàn)了抑癌基因PTEN（Phosphatase and Tensin Homologue）的過表達對腫瘤的抑制作用[17]。更值得一提的是：通過對MMTV.-Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型本身的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤來源于TEBs（terminal end buds）細胞[18]。而TEBs細胞為公認的乳腺干細胞，故通過MMTV.-Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠，將乳腺干細胞-乳腺腫瘤-Wnt信號通路有機地結(jié)合在一起[19]。相信以MMTV.-Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠為基礎(chǔ)，通過針對Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的基因，采用Knock in或Knock out技術(shù)，構(gòu)建缺失突變體或基因的過表達，將對乳腺癌的分子生物學(xué)特性有更深入的了解。而且針對各種干細胞的自我更新的信號通路的抗腫瘤藥物，也在研發(fā)中，以便解決腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移難題[20]。

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