內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷中的作用

李青檀, 王冬梅

（白求恩國際和平醫(yī)院心內(nèi)科, 石家莊 050082）

缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury,IRI）是一種由于供血障礙引起的應(yīng)激性疾病, 血供中斷后的一段時(shí)間恢復(fù), 可引起缺血組織發(fā)生較恢復(fù)前更嚴(yán)重的損傷?，F(xiàn)已證實(shí), 心、腦、肺、肝、腎、胃腸道、肢體及皮膚等組織器官均存在IRI。而以心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）最為多見。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum, ER）在維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和折疊方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到某些打擊（如缺血缺氧、藥物毒性等）后, ER內(nèi)氧化環(huán)境被破壞, 鈣代謝失調(diào), 導(dǎo)致ER功能發(fā)生紊亂, 突變蛋白質(zhì)產(chǎn)生或蛋白質(zhì)二硫鍵不能形成,引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚以及鈣穩(wěn)態(tài)失衡的狀態(tài), 即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）。因此, MIRI不可避免地會(huì)產(chǎn)生ERS。而ERS與細(xì)胞凋亡密不可分。研究表明, ER是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的重要環(huán)節(jié)。ERS可以介導(dǎo)與線粒體相關(guān)的內(nèi)源性途徑和死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑不同的一條新的凋亡通路。ER對影響細(xì)胞內(nèi)能量水平、氧化狀態(tài)或鈣離子濃度異常的應(yīng)激極度敏感。當(dāng)細(xì)胞遭到毒性藥物、感染、缺血缺氧等打擊時(shí), 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔未折疊蛋白增多和細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載, 過強(qiáng)和持續(xù)的ERS可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡[1], 在病毒感染、炎癥、神經(jīng)退行性病變、腦缺血、代謝綜合征、腫瘤和藥源性臟器損傷等發(fā)病過程中都存在ERS機(jī)制。探討 ERS在缺血性心肌病中的作用機(jī)制極具意義,并能指導(dǎo)臨床用藥, 探尋治療的新靶點(diǎn)。

1 ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

ER是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器, 是細(xì)胞的鈣儲(chǔ)存庫, 是分泌性蛋白和膜蛋白的合成、折疊、運(yùn)輸以及修飾的場所, 還參與固醇激素的合成及糖類和脂類代謝。ER對影響細(xì)胞內(nèi)能量水平、氧化狀態(tài)或鈣離子濃度異常的應(yīng)激極度敏感。

1.1 ERS介導(dǎo)的保護(hù)途徑

細(xì)胞或組織發(fā)生應(yīng)激后, ER通過激活未折疊蛋白反應(yīng)[2]（unfolded protein response, UPR）以保護(hù)由 ERS所引起的細(xì)胞損傷, 從而恢復(fù)細(xì)胞功能。UPR是由一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶包括熱休克蛋白家族的糖調(diào)節(jié)蛋白（binding immunoglobulin protein/glucose regulated protein78, BIP/GRP78）和 3個(gè)ER應(yīng)激感受蛋白所介導(dǎo)的, 分別是UPR激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、肌醇需求酶 1（inositol-requring enzyme1, IRE-1）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6, ATF6）。IRE1、PERK、ATF6 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的3種起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的跨膜蛋白, 它們均對腔內(nèi)未折疊蛋白（unfolded protein, UP）的聚集起作用。IRE1和PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白激酶, 沒有應(yīng)激情況下, 它們和BIP/GRP78形成穩(wěn)定的復(fù)合物, 而當(dāng)?shù)鞍族e(cuò)誤折疊或UP增多時(shí)則促使 BIP/GRP78 與其解離, IRE1和PERK 的寡聚化及其自身磷酸化, 從而刺激下游信號的激活。ATF6 是真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含有bZip轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型跨膜蛋白。當(dāng)UP在ER聚集增多時(shí), ATF6 向高爾基體轉(zhuǎn)位, 被 S1蛋白酶和S2蛋白酶切成p50 bZip轉(zhuǎn)錄因子到細(xì)胞核, 并激活如熱休克蛋白家族的糖調(diào)節(jié)蛋白（glucoseregulated protein78/94, GRP78/94）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase, PDI）、X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1, XBP1）、bZip類的一種真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的同源蛋白/生長停滯及DNA損傷基因153（C/EBP homologous protein/growth arrestand DNA damage inducible gene 153, CHOP/GADD153）[3]轉(zhuǎn)錄增加,導(dǎo)致UPR的活化。因此, UPR是一種機(jī)體對抗ERS的保護(hù)機(jī)制, 通過引發(fā) ER內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的正確折疊, 以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度, 來維持ER穩(wěn)態(tài), 促使細(xì)胞功能恢復(fù)。但如果ERS嚴(yán)重或應(yīng)激持續(xù)不緩解, 則將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。

1.2 ERS介導(dǎo)的凋亡途徑

PERK、IRE1以及 ATF6信號不僅能夠啟動(dòng)ERS的生存途徑, 嚴(yán)重或長時(shí)間的 ERS損傷了 ER的功能時(shí), 這3個(gè)信號途徑同樣能夠啟動(dòng)由ERS所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 然而它們并不是直接地引起細(xì)胞凋亡, 而是通過激活下游的凋亡信號分子, 如 CHOP/GADD153、C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase, JNK）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase-12）以及凋亡調(diào)控基因家族（Bcl-2）等[5]。

2 ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與了MIRI

缺血心肌恢復(fù)再灌注后, 出現(xiàn)心肌舒縮功能降低、心律失常、心肌超微結(jié)構(gòu)變化、能量代謝障礙等進(jìn)一步損害稱為MIRI。大量體內(nèi)體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡與 MIRI等心血管疾病有密切關(guān)系。Fliss等[6]采用原位末端標(biāo)記和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)確定在缺血和缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）大鼠心肌細(xì)胞中有典型的凋亡形態(tài)改變和DNA梯形格局, 認(rèn)為缺血和I/R心肌均可發(fā)生細(xì)胞凋亡, 且再灌注可加速不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞凋亡;這主要與再灌注后, 細(xì)胞內(nèi)ATP水平迅速恢復(fù)、胞漿和線粒體內(nèi)鈣超載以及自由基大量生成等因素加速了細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。Okada等[7]用藥物誘導(dǎo)的ERS導(dǎo)致CHOP的表達(dá)升高, Caspase-12裂解, 并通過 Tunel的方法觀察到了凋亡細(xì)胞, 從而證實(shí) ERS和凋亡在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中有相關(guān)性。Martindale等[8]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 當(dāng)新生小鼠心肌細(xì)胞在體外經(jīng)I/R處理后, ERS誘導(dǎo)的 UPR的標(biāo)志物 GRP78和GRP94的水平升高, 提示 IRI介導(dǎo)了 ERS。基因芯片研究顯示, 小鼠心肌梗死的24h內(nèi), 大量ERS反應(yīng)基因如GRP78, XBP1, ATF4, 賴-天冬-谷-亮氨酸的四肽序列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白受體3被誘導(dǎo)[9]; Qi等[10]報(bào)道, 離體大鼠心臟缺血 35min, 再灌注 60min時(shí)GRP78、XBP1及 p-JNK表達(dá)升高。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明, 模擬缺血條件下（血清、葡萄糖及氧氣剝奪）能激活體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的ERS反應(yīng), 早期表現(xiàn)為促生存的GRP78、XBP1表達(dá)增加及eIF2α磷酸化,晚期表現(xiàn)為促凋亡的CHOP和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12（caspase-12）前體表達(dá)增加[11]。上述研究充分證明, 在缺血或I/R過程中, ERS不僅是激活的, 而且在MIRI和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子可以作為缺血或I/R心肌損傷的標(biāo)志物

ERS的早期主要是 ER伴侶分子 GRP78、GRP94、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin, CRT）表達(dá)上調(diào)和PERK-eIF2α磷酸化介導(dǎo)的蛋白合成暫停[12]。因此,心肌缺血早期和代償階段主要出現(xiàn)GRP78、CRT表達(dá)和 PERK、eIF2α磷酸化的上調(diào), 表明細(xì)胞通過ERS調(diào)節(jié)自穩(wěn)態(tài)失衡。而當(dāng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重, 出現(xiàn)凋亡和心力衰竭時(shí), ERS相關(guān)凋亡信號途徑活化, 表現(xiàn)為CHOP表達(dá)上調(diào)、JNK和caspase-12及其級聯(lián)反應(yīng)的活化[13]。培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子CRT、GRP78和CHOP的表達(dá)并促進(jìn) caspase-12的剪切活化[7]。在小鼠心臟特異性表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1, MCP-1）所致缺血性心肌病中, GRP78和PDI表達(dá)增加[14]。在大鼠心肌梗死模型上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), I/R誘導(dǎo) ER分子 CRT表達(dá)明顯增多, 并出現(xiàn)ERS, 與心肌損傷呈正相關(guān)[15]。我們發(fā)現(xiàn), 在急性冠狀動(dòng)脈綜合征（acute coronary syndrome, ACS）患者破裂斑塊組織[16]中 ER的標(biāo)志分子 C末端賴-天冬-谷-亮氨酸的四肽序列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白受體3和CHOP的免疫組化染色呈強(qiáng)陽性, 提示ACS患者的高風(fēng)險(xiǎn)與ERS有關(guān)。

2.2 ERS有望成為MIRI防治的新靶點(diǎn)

作為應(yīng)激時(shí)細(xì)胞的最初反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)其他亞細(xì)胞器反應(yīng)的共同通路, 適度的ERS是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制, 有助于細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。調(diào)控ERS將從整合調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激的角度為I/R后心肌重塑的防治提供新思路[17]。具有多種心血管保護(hù)作用的活性肽通過抑制ERS反應(yīng)減輕I/R性心肌損傷[18]; 離體與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 抑制 CHOP表達(dá)可以減輕缺血和再灌注引起的細(xì)胞凋亡, 延緩肥大心肌轉(zhuǎn)向衰竭[19]。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）的活化與 eIF2磷酸化有關(guān), 藥物激活A(yù)MPK可降低心肌細(xì)胞ERS反應(yīng), 減輕細(xì)胞缺氧損傷[20]; Derl3基因編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解（ER-associated degradation, ERAD）機(jī)制中的重要成分, 過表達(dá)Derl3能增強(qiáng)ERAD, 保護(hù)心肌細(xì)胞免于模擬缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[21]; 抑制脯氨酰羥化酶能顯著降低缺血后心臟 CHOP的表達(dá), 誘導(dǎo)再灌注心臟ATF4、GRP78和α甘露糖苷酶樣ER降解增強(qiáng)蛋白表達(dá), 減輕缺血后心肌損傷[22]; 在小鼠的心臟中過表達(dá)活化的 ATF6, 能夠降低心臟 IRI, 增強(qiáng)心室泵功能[8]; 缺血預(yù)處理和后處理這兩種內(nèi)源性心臟保護(hù)現(xiàn)象均可以減輕長期缺血和（或）再灌注引起的嚴(yán)重ERS, 并減輕細(xì)胞損傷[15]。

3 鈣穩(wěn)態(tài)失衡與ERS

研究表明, I/R時(shí)心肌肌質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵[sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA]及Ca2+釋放通道蛋白基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平明顯下調(diào)[23],心肌鈣調(diào)蛋白依賴性激酶、蛋白激酶A對SERCA,受磷蛋白的磷酸化作用明顯降低[24], 影響 ER膜上SERCA及Ca2+通道的功能狀態(tài), 最終造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載。ERS發(fā)生后, 通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白如CRT, 進(jìn)而調(diào)節(jié) SERCA和細(xì)胞漿內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性、肌質(zhì)網(wǎng)三磷酸肌醇通道的 Ca2+釋放和細(xì)胞膜L型Ca2+通道Ca2+內(nèi)流等作用, 調(diào)節(jié)細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)。Zhang等利用培養(yǎng)的心肌細(xì)胞系H9c2以衣霉素預(yù)處理誘導(dǎo)ERS, 發(fā)現(xiàn)H9c2、GRP78 mRNA水平和蛋白水平均升高, 在長時(shí)間的ATP耗竭和氧化應(yīng)激誘導(dǎo) I/R損傷下, 衣霉素預(yù)處理組心肌細(xì)胞較對照組乳酸脫氫酶釋放水平明顯降低, 更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)用咖啡因和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑處理心肌細(xì)胞時(shí), 預(yù)處理組向胞漿釋放的Ca2+水平明顯高于對照組, 表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有更高的Ca2+儲(chǔ)存。氧化應(yīng)激前后預(yù)處理組細(xì)胞質(zhì)的Ca2+水平維持較對照組穩(wěn)定。以上結(jié)果顯示, 預(yù)先誘發(fā)ERS可通過改善再灌注損傷時(shí)鈣超載保護(hù)心肌細(xì)胞免受致命的損傷[25]。

鈣激活中性蛋白酶（calpain）是一族鈣離子依賴性的、水解半胱氨酸的蛋白酶。有研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣失衡誘導(dǎo) ERS 發(fā)生時(shí), 激活 calpain, 降解細(xì)胞骨架、膜蛋白以及各種激酶以及轉(zhuǎn)錄因子, 最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在許多疾病中都發(fā)現(xiàn)了 calpain 活性的異常, 如神經(jīng)損害性疾病, 缺血與外傷性腦損傷、癌癥、肌營養(yǎng)不良、白內(nèi)障、腦卒中及糖尿病。它還與腦、心臟及腎的缺血性損傷的細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。因此可通過鈣蛋白酶抑制劑抑制細(xì)胞凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn), calpain抑制劑可以明顯抑制大鼠I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡; 降低癌癥的病變程度, 改善和提高正常組織的功能; 預(yù)防心臟、腦、肝及腎細(xì)胞的缺血性細(xì)胞凋亡。但迄今為止, 對于calpain及抑制劑在心肌I/R的研究極少。

ER鈣穩(wěn)態(tài)失衡是 ERS的一個(gè)早期事件, 若能及早穩(wěn)定 ER鈣水平, 就可能抑制和消除 UPR。calpain可能是這些疾病的一個(gè)理想的治療靶點(diǎn), 因此, 對于calpain及其抑制劑的深入研究對疾病的治療具有重要意義。

4 結(jié) 語

I/R本身是個(gè)多因素協(xié)同作用過程, ERS在其中所起的作用已有了較為廣泛的研究, 它與 IRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡之間的聯(lián)系也已經(jīng)在很多實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。但是對于ER介導(dǎo)的MIRI細(xì)胞凋亡途徑還需要大量的研究來闡明其具體的機(jī)制。如何通過阻斷ER凋亡通路中不同的信號調(diào)控因子和凋亡執(zhí)行因子來減少細(xì)胞功能喪失, 很可能成為將來治療相關(guān)疾病的新途徑。對于 MIRI所發(fā)生的細(xì)胞凋亡的研究還有大量工作去做, 必須從分子機(jī)制上進(jìn)行深入研究,這或許會(huì)開辟解決心血管疾病治療的新思路。

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