外加低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)對(duì)兔腹主動(dòng)脈球囊損傷后血管新生內(nèi)膜增生的影響

劉志濤, 張 萍, 何國(guó)祥, 劉建平

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院心血管內(nèi)科, 重慶 400038）

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（percutaneous coronary intervention, PCI）治療術(shù)對(duì)動(dòng)脈的損傷會(huì)引起一系列的變化, 導(dǎo)致靶病變處血管新生內(nèi)膜形成及增生,造成再狹窄（restenosis, RS）。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）的增殖和遷移是 RS 的主要病理機(jī)制[1]。組織損傷后傷口及其附近上皮存在的損傷電流場(chǎng)源是一種穩(wěn)恒直流電場(chǎng),部分離體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn), 外加電場(chǎng)可以影響內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs的增殖、遷移以及細(xì)胞的排列[2]。本研究探討外加穩(wěn)恒直流電場(chǎng)對(duì)兔腹主動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的影響及其意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康日本大耳白兔 65只, 雌雄不限, 體質(zhì)量（1.98±0.23）kg, 由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依照第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)許可的協(xié)議進(jìn)行。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=5）、假手術(shù)組（n=24）及實(shí)驗(yàn)組（n=36）。假手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組手術(shù)過(guò)程完全相同, 也埋置電極但不給予電場(chǎng)刺激。假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組分別觀察至術(shù)后1天、1周、2周以及4周, 實(shí)驗(yàn)組根據(jù)施加電場(chǎng)強(qiáng)度不同分為3.0V/cm和4.0V/cm兩個(gè)亞組, 術(shù)后第2天開始電治療。

1.2 主要試劑、材料和儀器

HE染色; 天狼猩紅購(gòu)自海泛柯生物科技有限公司; 鼠抗兔Ⅰ型膠原單克隆抗體購(gòu)自 Abcam 公司; 鼠抗兔Ⅲ型膠原單克隆抗體購(gòu)自 Calbiochem公司; GAPDH（V-18）購(gòu)自Santa Cruz公司; WYJ數(shù)字顯示高精度直流穩(wěn)壓電源購(gòu)自上海山杰科技有限公司; Western blot凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司; 顯微鏡下圖像應(yīng)用 Olympus BX51顯微圖像采集系統(tǒng)采集; 圖像分析均使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件; Western blot結(jié)果分析使用 Quangtity One軟件。自制鉑電極（電極直徑0.40 mm, 長(zhǎng)20 mm,導(dǎo)線長(zhǎng)約30 cm）。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建

兔經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥1ml/kg麻醉。分離兔右側(cè)股動(dòng)脈約 2～3cm 長(zhǎng), 縱向逐層切開下腹壁暴露腹腔, 顯示腹主動(dòng)脈下段與髂總動(dòng)脈分叉處。從股動(dòng)脈插入帶有PTCA導(dǎo)絲支持的2.5 mm×20.0 mm PTCA球囊, 推送至腹主動(dòng)脈下段, 使球囊頭端距離腹主動(dòng)脈分叉處5.0 cm。球囊加壓至12標(biāo)準(zhǔn)大氣壓（atmospheric pressure, atm）后, 回拉球囊直至髂總動(dòng)脈分叉處, 然后釋放壓力。以上過(guò)程共3次, 每次間隔時(shí)間1min。術(shù)畢, 撤出球囊導(dǎo)管, 結(jié)扎股動(dòng)脈近端。將兩針狀鉑電極分別插入兔腹主動(dòng)脈兩側(cè)腰大肌縫扎固定, 保持兩電極平行, 電極距離腹主動(dòng)脈約 1cm, 電極下端與腹主動(dòng)脈與髂動(dòng)脈分叉處持平。將兩電極導(dǎo)線通過(guò)皮下隧道引至兔頸后,縫扎固定于體外。慶大霉素溶液沖洗腹腔后, 逐層縫合皮下及皮膚, 青霉素400 000U肌內(nèi)注射3d。

1.4 血管新生內(nèi)膜增生的觀察

將 10%中性甲醛固定的血管組織常規(guī)石蠟包埋,切片, HE染色后顯微鏡下觀察, 通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0分析內(nèi)膜、中膜面積, 計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比值。

1.5 天狼猩紅染色

將石蠟包埋的血管組織切片, 用天狼猩紅染色,在暗視野條件下, 偏振光顯微鏡觀察。天狼猩紅染色后, 膠原纖維呈現(xiàn)不同的折光性和顏色, Ⅰ型膠原纖維緊密排列, 顯示很強(qiáng)的雙折光性, 為黃色或紅色的纖維。Ⅱ型膠原纖維有弱的雙折光性, 為各種不同顏色的疏松網(wǎng)狀。Ⅲ型膠原纖維顯示弱的雙折光性, 呈綠色的細(xì)纖維。

1.6 Western blot測(cè)定血管組織I型、III型膠原蛋白表達(dá)

血管組織中總蛋白提取后, 蛋白質(zhì)定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 測(cè)定樣品濃度, 灌制 10%SDS-PAGE, 上樣量為 30μg, Bio-Rad公司 Mini系電泳槽進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)至 PVDF膜, 加入一抗、二抗等系列操作后用凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描成像, 并用Quantity One-4.4.0圖像分析軟件進(jìn)行分析, 蛋白表達(dá)量以“目的蛋白/GAPDH”的光密度比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用±s表示。采用SPSS11.5軟件行單因素方差分析,L.S.D-t檢驗(yàn)及Dunnett-t檢驗(yàn)作為驗(yàn)后多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況

本研究65只動(dòng)物中, 1只動(dòng)物死于腹腔感染, 1只死于腸梗阻, 1只無(wú)明顯原因死亡, 將這3只動(dòng)物剔除。其余兔健康存活, 納入研究。

2.2 外加電場(chǎng)對(duì)血管損傷后內(nèi)/中膜面積比值的影響

HE染色后光鏡下觀察可見(jiàn), 假手術(shù)組正常動(dòng)脈內(nèi)膜僅見(jiàn)單層內(nèi)皮細(xì)胞, 內(nèi)皮層下未見(jiàn)有中膜VSMCs潛入。球囊損傷1d后, 動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫, 管腔內(nèi)表面尚無(wú)增殖的VSMCs。內(nèi)膜損傷后1周, 新生內(nèi)膜形成并逐漸增厚, 其中可見(jiàn)較多增殖的VSMCs,分布不均, 排列紊亂, 內(nèi)/中膜面積比為（8.43±1.39）%。內(nèi)膜損傷2周后, 新生內(nèi)膜厚度明顯增加,最厚處約為中膜厚度的 1/2, 內(nèi)/中膜面積比為（20.88±1.84）%。損傷后4周, 新生內(nèi)膜繼續(xù)增厚,最厚處約等于中膜厚度, 內(nèi)/中膜面積比為（46.92±5.79）%。在3.0V電場(chǎng)干預(yù)組, 內(nèi)膜損傷后1周、2周及 4周內(nèi)/中膜面積比分別為（8.28±1.31）%,（16.12±2.65）%, 及（28.07±3.63）%, 與對(duì)照組相比顯著減?。≒＜0.01）。在4.0V電場(chǎng)干預(yù)組, 內(nèi)膜損傷后1周、2周及4周內(nèi)/中膜面積比分別為（7.93±1.76）%,（14.80±1.51）%及（27.58±4.27）%, 也明顯小于假手術(shù)組（P＜0.01）, 但與3.0V組比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05; 圖1, 圖2）。

2.3 外加電場(chǎng)對(duì)血管損傷后Ⅰ型、Ⅲ型膠原的影響

天狼猩紅染色后偏振光纖維鏡下觀察, 可見(jiàn)各組血管壁內(nèi)較豐富橙黃色Ⅰ型膠原, 主要分布于外膜, 僅有較少量綠色Ⅲ型膠原表達(dá)。術(shù)后1周, 各組新生內(nèi)膜已形成, 但內(nèi)膜中未見(jiàn)橙黃色和綠色條紋。術(shù)后2周, 新生內(nèi)膜厚度明顯增加, 內(nèi)膜中可見(jiàn)少許橙黃色條紋, 在電場(chǎng)干預(yù)3.0V、4.0V組新生內(nèi)膜厚度小于對(duì)照組, 內(nèi)膜中未見(jiàn)橙黃色條紋; 術(shù)后4周, 新生內(nèi)膜繼續(xù)增厚, 新生內(nèi)膜中可見(jiàn)較多的橙黃色斑條紋, 并有少許綠色細(xì)條紋夾雜其中, 在電場(chǎng)干預(yù)3.0V、4.0V組, 新生內(nèi)膜厚度小于假手術(shù)組, 新生內(nèi)膜中的橙黃色斑條紋較對(duì)照組顯著減少（圖3, 圖4）。Western blot結(jié)果顯示, 在術(shù)后4周,無(wú)論是3.0V還是4.0V實(shí)驗(yàn)亞組, 其I、III型膠原蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05; 圖5, 圖 6）。

3 討 論

血管損傷后的內(nèi)膜增生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞損傷誘導(dǎo)血栓形成, 血栓形成后的 24h內(nèi),VSMCs即開始增生。正常內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生很多因子如前列環(huán)素和硫酸類肝素等, 這些物質(zhì)抑制VSMCs增殖[3]。損傷的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生硫酸類肝素量減少, 同時(shí)由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的其他抑制VSMCs增殖的因子如一氧化氮的產(chǎn)量亦降低, 而死亡或損傷的內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs釋放許多促增殖物質(zhì), 刺激VSMCs增殖[4]。因此, 血管壁損傷后降低了抑制性生長(zhǎng)因子的產(chǎn)量而增加了刺激性生長(zhǎng)因子的表達(dá)量, 使其平衡向有利于VSMCs增殖的方向移動(dòng)。新生內(nèi)膜的最終形成是 VSMCs通過(guò)增殖聚集, 持續(xù)性遷移或者是兩者的結(jié)果, 同樣也是大量細(xì)胞外基質(zhì)合成的結(jié)果。VSMCs聚集過(guò)程和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生緊密聯(lián)系, 刺激 VSMCs增殖的相同因子, 同時(shí)也增加細(xì)胞外基質(zhì)的含量[3]。

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)/中膜面積比Figure 1 Ratio of the tunica intima area to media area of the neointima

圖2 各組不同時(shí)相點(diǎn)新生內(nèi)膜增生情況Figure 2 Neointimal formation of the abdominal aorta after balloon injury operation in different groups (HE×100)

圖3 天狼猩紅染色術(shù)后4周各組間內(nèi)膜Ⅰ型膠原比較Figure 3 Expressions of type-I collagens in different groups at 4 weeks after surgery (Sirius red dye staining)

圖4 術(shù)后4周各組間內(nèi)膜Ⅰ型膠原單位面積光密度值比較Figure 4 Absorbance value of type-I collagens in different groups at 4 weeks after surgery

圖5 Western blot檢測(cè)血管Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression of type-I collagens detected by western blot

圖6 Western blot檢測(cè)血管Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)Figure 6 Expression of type-III collagens detected by western blot

唐波等[5]的研究發(fā)現(xiàn), 在外加直流電場(chǎng)的作用下, VSMCs 向電場(chǎng)陰極面作定向遷移, 遷移速度也明顯增加, 電場(chǎng)作用下 VSMCs 的定向遷移是與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的一種主動(dòng)行為, 而不是在電場(chǎng)作用下的一種被動(dòng)的泳動(dòng)。Azadniv 等[6]的研究也發(fā)現(xiàn),外加電場(chǎng)可以抑制體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的增殖。以上研究均表明, 外加電場(chǎng)可以影響 VSMCs的增殖和遷移。本研究中發(fā)現(xiàn), 球囊損傷后2周及4周,新生內(nèi)膜厚度顯著增加; 3.0V及4.0V實(shí)驗(yàn)亞組內(nèi)皮損傷后 2周及 4周的內(nèi)/中膜面積比均顯著小于對(duì)照組（P＜0.05,P＜0.01）, 但不同實(shí)驗(yàn)亞組間相比, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明外加一定強(qiáng)度范圍的穩(wěn)恒直流電場(chǎng)可以抑制新生內(nèi)膜的形成。

目前的研究表明, 細(xì)胞外基質(zhì)的重建, 尤其膠原纖維的重建（Ⅰ型、Ⅲ型膠原）與 VSMCs遷移和增生有密切的關(guān)系, 血管內(nèi)膜損傷后增生的細(xì)胞外基質(zhì)主要來(lái)自于中膜的 VSMCs和外膜活化后的肌成纖維細(xì)胞, 細(xì)胞外基質(zhì)是 VSMCs增殖所必需的。Abid等[7]的研究顯示, 自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖的同時(shí),Ⅰ, Ⅲ型膠原 mRNA的表達(dá)增加, VSMCs增殖伴細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。血管細(xì)胞外基質(zhì)是維持血管壁結(jié)構(gòu)完整和功能正常的必要保證,正常動(dòng)脈血管中的膠原以Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型為主,主要由VSMCs合成分泌[8]。

我們的研究發(fā)現(xiàn), 天狼猩紅染色后偏振光纖維鏡下觀察, 正常血管壁內(nèi)的膠原以Ⅰ型膠原為主,主要分布于外膜, 少量Ⅲ型膠原夾雜其中, 明顯少于Ⅰ型膠原。術(shù)后1周, 各組新生內(nèi)膜已形成, 但內(nèi)膜中均未見(jiàn)Ⅰ, Ⅲ型膠原。術(shù)后2周, 新生內(nèi)膜厚度明顯增加, 內(nèi)膜中可見(jiàn)少許Ⅰ型膠原, 在3.0V, 4.0V實(shí)驗(yàn)亞組新生內(nèi)膜厚度小于對(duì)照組, 內(nèi)膜中未見(jiàn)Ⅰ,Ⅲ型膠原; 術(shù)后4周, 新生內(nèi)膜繼續(xù)增厚, 新生內(nèi)膜中可見(jiàn)較多的Ⅰ型膠原, 并有Ⅲ型膠原夾雜其中;3.0V和4.0V實(shí)驗(yàn)亞組新生內(nèi)膜厚度小于對(duì)照組, 新生內(nèi)膜中的Ⅰ型膠原明顯少于對(duì)照組。3.0V和4.0V亞組之間內(nèi)膜膠原含量未見(jiàn)差異。這表明外加電場(chǎng)在抑制新生內(nèi)膜形成的同時(shí)也抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。Western blot結(jié)果顯示, 在術(shù)后4周, 3.0V亞組、4.0V亞組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比, 差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 3.0V亞組、4.0V亞組Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 表明電場(chǎng)干預(yù)沒(méi)有改變血管壁總的膠原蛋白含量, 這可能是因?yàn)檠鼙诳偰z原蛋白主要由血管外膜膠原蛋白組成, 血管內(nèi)膜內(nèi)的膠原蛋白含量變化對(duì)血管總膠原蛋白含量的變化無(wú)明顯影響。

既往有研究發(fā)現(xiàn), 外加電場(chǎng)可以促進(jìn)新生內(nèi)膜增生, 從而形成管腔的狹窄, 這一作用甚至被人們用來(lái)制作血管損傷模型[9]。但在這些研究中產(chǎn)生血管損傷作用的電場(chǎng)均為高頻脈沖電場(chǎng), 刺激電流均高于 1mA, 并且刺激電極與血管外膜緊密接觸, 而我們采用的是低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng), 刺激電極置于腰大肌內(nèi), 不與血管直接接觸, 經(jīng)過(guò)血管的電流極小。這可能是本研究中血管產(chǎn)生不同效應(yīng)的主要原因。

總之, 外加適宜的低壓穩(wěn)恒電場(chǎng)可以抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的形成, 同時(shí)抑制血管內(nèi)膜 I型膠原蛋白的生成, 這可能有助于改善血管損傷后內(nèi)皮依賴性舒張功能。

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