滅蚊真菌貴陽(yáng)腐霉總RNA提取方法的建立

段斯亮 于 聲 蘇曉慶

(柳州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，①檢驗(yàn)教研室 廣西柳州 545006;②貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室)

滅蚊真菌貴陽(yáng)腐霉總RNA提取方法的建立

段斯亮 于 聲①蘇曉慶②

(柳州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，①檢驗(yàn)教研室 廣西柳州 545006;②貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室)

①目的 提取貴陽(yáng)腐霉(Pythium guiyangense)的總RNA。②方法 誘導(dǎo)后的菌絲加入硅藻土，用液氮研磨成粉末狀，在變性劑存在的條件下，用酚/氯仿/異戊醇抽提，除去DNA和蛋白質(zhì)，再用醋酸鈉和70%乙醇沉淀RNA，去除多糖。③結(jié)果 用該方法提取的RNA樣品，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280=1.98，OD260/OD230=2.30;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28SrRNA帶的亮度約為18SrRNA帶的2倍。④結(jié)論 成功地提取了貴陽(yáng)腐霉總RNA，且RNA的純度和完整性很好，能夠達(dá)到進(jìn)行分子生物學(xué)領(lǐng)域其他操作研究的標(biāo)準(zhǔn)。

貴陽(yáng)腐霉 硅藻土 RNA提取

在基因表達(dá)調(diào)控研究中，RT－PCR(逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈反應(yīng))、Northern分析、cDNA文庫(kù)(含一種生物體所有基因編碼的cDNA分子的克降群)的構(gòu)建等都需要高質(zhì)量的RNA，獲得完整性良好的RNA已成為分子生物學(xué)各研究領(lǐng)域首先要解決的問(wèn)題。在所有的RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶很穩(wěn)定，一般而言反應(yīng)不需要輔助因子，而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起嚴(yán)重的后果。目前，許多RNA提取方法已建立起來(lái)，這些方法均用到RNAase(核糖核酸酶)的抑制劑如肌鹽、酚、氯仿、氯化艷密度梯度離心等［1～3］，但是，仍有不少實(shí)驗(yàn)材料由于富含RNA酶、多糖、多酚等物質(zhì)或者降解RNA及與RNA形成難溶物等方式嚴(yán)重干擾RNA的提?。?，5］，常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。我們?cè)谟肦T－PCR克隆貴陽(yáng)腐霉的類枯草菌素蛋白酶基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)用一步法提取RNA，結(jié)果并不理想，污染和降解現(xiàn)象較多。為了解決上述問(wèn)題，我們?cè)趨⒖级喾NRNA提取技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一種簡(jiǎn)單、有效的適合腐霉菌的RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。貴陽(yáng)腐霉(P.guiyangense)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基。SFE 培養(yǎng)基［6］，誘導(dǎo)培養(yǎng)基［7］。

1.1.3 主要試劑。RNA提取液為:異硫氫酸胍6 mol/L，Tris－ HCl(pH 7.5)0.2 mol/L ，NaCl 0.5mol/L，EDTA 0.01 mol/L，SDS 1%，0.15mol/L β － 巰基乙醇;硅藻土;酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1);NaAc(3mol/L，pH5.5);70%乙醇(DEPC 水配制);異丙醇。

1.2 方法 切取1cm×1cm SFE培養(yǎng)基活化5天的菌塊，轉(zhuǎn)入100mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基，26℃，110rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至所需時(shí)間，收集菌絲，用DEPC－H2O過(guò)濾沖洗干凈并濾干(盡量干燥)。置于研缽中加入硅藻土，倒入液氮研磨至粉末狀，趁液氮尚未揮發(fā)光，把粉末(約0.8g)轉(zhuǎn)移到RNase－free的1.5mL離心管中，加入1.0mLRNA提取液，劇烈振蕩混勻，冰浴15min。加入200μL酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1)混勻，冰浴 15min。4℃，12000r/min離心20min。取上清移入另一RNase－free的1.5mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1)再抽提一次;轉(zhuǎn)移上清，加入等體積冰凍異丙醇，－20℃放置60min。4℃，12000r/min離心20min。棄上清液，將RNA沉淀用DEPC－Water溶解，加入 1.5mL 3mol/L NaAc，0℃ 過(guò)夜。4℃，10000r/min離心20min。用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫晾干，加入30μL DEPC－Water溶解沉淀。立即使用或－70℃保存。

1.3 RNA質(zhì)量的檢驗(yàn)

1.3.1 RNA的純度。用BECKMAN紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品在 230nm、260nm、280nm 處的 OD值，計(jì)算 OD260/OD230、OD260/OD280的結(jié)果。

1.3.2 RNA的完整性。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，28SRNA與18SRNA的亮度比約為2。

2 結(jié)果

2.1 RNA的純度 吸取1μLRNA，用99μL超純水稀釋100倍，在BECKMAN紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)，OD260/OD280=1.98，OD260/OD230=2.30，說(shuō)明RNA純度很高，無(wú)蛋白質(zhì)、酚類污染。

2.2 RNA的完整性 取1μgRNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠(含1μg/mL溴化乙錠)電泳，130v電泳40min后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果顯示28SrRNA、18SrRNA與5SrRNA帶型整齊，無(wú)拖尾，而且28S帶的亮度約為18S帶的2倍，5S帶的亮度較低，說(shuō)明RNA完整性很好，點(diǎn)樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染。見(jiàn)圖1。

圖1 貴陽(yáng)腐霉RNA電泳圖

3 討論

貴陽(yáng)腐霉是一種絲狀真菌，富含RNase、多酚、多糖。多糖具有與RNA相似的理化性質(zhì)，在提取總RNA時(shí)，多糖等易與RNA一起沉淀下來(lái)，RNase易使RNA發(fā)生降解［8］。所以使用一步法提取RNA，污染和降解現(xiàn)象嚴(yán)重?？紤]到以上因素，本方法特別采用了能吸附RNA酶的硅藻土研磨。一般的提取方法都是采用液氮研磨，但由于真菌材料使用了液體培養(yǎng)，即使過(guò)濾后菌絲體仍含有較多的水分，液氮冷凍會(huì)形成冰晶而妨礙研磨。研磨時(shí)間越長(zhǎng)，就越增加RNA酶污染的機(jī)會(huì)。而硅藻土是一種黏土，能吸附RNA酶［9］，有效抑制RNase活性，而且使得研磨過(guò)程更加容易和快速。并且實(shí)驗(yàn)中把變性劑中異硫氫酸胍的濃度提高1.5倍，在細(xì)胞破碎后能強(qiáng)烈抑制RNase活性。一步法使用酚/氯仿/異戊醇抽提一次，DNA污染嚴(yán)重;而本方法用酚/氯仿/異戊醇多次抽提，使RNA留在水相而DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，能將蛋白質(zhì)清除干凈，去除DNA污染。用醋酸鈉沉淀RNA粗品，能除去高含量的多糖，結(jié)果表明，此步的改動(dòng)較一步法可除去絕大部分的多糖，且RNA樣品完好。

在檢測(cè)RNA樣品的完整性時(shí)，考慮到變性瓊脂糖凝膠電泳較麻煩，且上樣量較多，我們采用了非變性瓊脂糖凝膠電泳。從圖1中可見(jiàn)，RNA電泳后28S、18SrRNA與EB的結(jié)合量比值約為2:1，表明RNA未發(fā)生明顯降解;點(diǎn)樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染;28SrRNA后拖尾，可能與上樣量較多有關(guān)，也與采用非變性瓊脂糖凝膠電泳有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法能夠獲得高純度完整的RNA，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)的一步法，適用于富含RNase和多糖的腐霉菌絲總RNA的提取，為貴陽(yáng)腐霉功能基因的表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其它真菌總RNA的提取提供了一定的參考依據(jù)。

［1］ Baker S S，Rugh C L，Kamalay J C.RNA and DNA isolation from recalcitrant plant tissues［J］.BioTechniques，1990，9(3):268

［2］ Mullin A E，Soukatcheva G，Verchere C B，et al.Application of insitu ductal perfusion to facilitate isolation of high－quality RNA from mouse pancreas［J］.Biol Techniques，2006，40(5):617

［3］ Levi A，Galau G A，Wetzstein H Y.A rapid procedure for the isolation of RNA from high － phenolic － containing tissues of pecan［J］.Hort Sci，1992，27(12):1316

［4］ 李 宏，王新力.植物組織RNA提取的難點(diǎn)及對(duì)策［J］.生物技術(shù)通報(bào)，1999，15(1):36

［5］ Lewinsohn E，Steele C L，Croteau R.Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms［J］.Plant Mol Biol Rep，1994，12(1):20

［6］ Jaronski st.Simplified production system for the fungus Lagenidium giganteum for operational mosquito control［J］.Mogwto news，1984，44(3):377

［7］ 王榮新.貴陽(yáng)腐霉(Pythium guiyangense)Pr1蛋白酶的誘導(dǎo)、初步純化及其酶學(xué)特性研究［D］.貴陽(yáng):貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，2005

［8］ 方衛(wèi)國(guó)，楊星勇，張永軍，等.真菌核酸的一種快速提取方法［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2002，8(3):305

［9］ Even S，Lindley N D，Cocaign－Bousquet M.Molecular physiology of sugar catabolism in Lactococcus lactis IL1403［J］.J Bacteriology，2001，183(13):3817

R 392

A

2095－2694(2012)01－020－02

廣西教育廳科研項(xiàng)目(編號(hào):200810MS026)，柳州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校碩士研究生科研啟動(dòng)項(xiàng)目(編號(hào):2007Y01)。

(2011－08－29 收稿)(王一伊 編輯)