應(yīng)用Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗檢測環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C和氨芐西林鈉致癌作用

宋征，劉全海，馬璟

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院1.國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203;2.藥理室，上海200083)

應(yīng)用Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗檢測環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C和氨芐西林鈉致癌作用

宋征1，劉全海2，馬璟1

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院1.國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203;2.藥理室，上海200083)

目的采用Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗檢測已知有遺傳毒性的化學(xué)品在化學(xué)致癌中的引發(fā)和促生長作用，評價Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗檢測化學(xué)品致癌作用的可靠性。方法①通過細胞毒性實驗確定環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C和氨芐西林鈉進行Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗的濃度。②引發(fā)實驗:細胞接種當(dāng)日為第0天，第1天換成含有相應(yīng)最終濃度的受試物或0.5%DMSO的DF5F培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，第4天換成不含藥物的DF5F培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第21天。第22天將細胞固定、染色、并計數(shù)細胞數(shù)大于50的集落數(shù)。③促生長實驗:接種當(dāng)日為第0天，第4天換成含有相應(yīng)受試物或0.5%DMSO的DF5F培養(yǎng)基并連續(xù)培養(yǎng)至第14天，期間第7天，第11天更換同樣培養(yǎng)基，每15天換成不含藥物的DF5F培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第21天。第22天固定、染色細胞、計數(shù)細胞數(shù)大于50的集落數(shù)。結(jié)果按照70%的細胞存活率以及前期文獻結(jié)果確定最終濃度為:氨芐西林鈉1750 mg·L－1;環(huán)磷酰胺1300 mg·L－1;絲裂霉素C 0.01 mg·L－1;3-甲基膽蒽1 mg·L－1，佛波酯0.05 mg·L－1。引發(fā)實驗結(jié)果顯示，3-甲基膽蒽，絲裂霉素C和環(huán)磷酰胺集落數(shù)顯著多于空白對照、并且兩者比值＞2，判定為有引發(fā)作用的致癌化學(xué)品。促生長實驗結(jié)果顯示，佛波酯集落數(shù)顯著多于空白對照、并且兩者比值大于2，因此判定為有促生長作用的致癌化學(xué)品。結(jié)論Bhas42細胞轉(zhuǎn)化實驗不僅可以檢測出遺傳實驗可檢測出的致癌陽性化學(xué)品和非致癌化學(xué)品，還可檢測出遺傳實驗結(jié)果為假陰性的致癌陽性化學(xué)品，可以作為一種快速易操作的致癌物預(yù)測體外模型。

Bhas42細胞;引發(fā)實驗;促生長實驗

化學(xué)致癌物分為引發(fā)物和促癌物，部分具有遺傳毒性的化合物可采用常規(guī)的遺傳毒理實驗檢測。但根據(jù)文獻報道，國際癌癥研究機構(gòu)歸類為1，2A和2B級別的致癌物中有12%為非遺傳致癌物［1］，常規(guī)的遺傳毒理實驗無法檢測此類化學(xué)品，因此建立可用于非遺傳致癌物檢測的實驗方法非常迫切及重要。

細胞轉(zhuǎn)化實驗是指對培養(yǎng)細胞誘發(fā)與腫瘤形成有關(guān)的表型改變，此種表型改變包括細胞形態(tài)、細胞生長能力、生化表型等變化，以及移植于動物體內(nèi)形成腫瘤的能力等。1986年時日本學(xué)者Sasaki等［2］已經(jīng)建立了BALB/c3T3二階段細胞轉(zhuǎn)化實驗，該實驗的兩個階段分別為引發(fā)階段及促生長階段。引發(fā)階段即在培養(yǎng)皿中接種低濃度的細胞，在細胞進入分裂增殖期時加入受試物，在實驗?zāi)⒓毎潭ㄈ旧?，再通過檢測細胞形態(tài)學(xué)上的改變來判斷受試物的引發(fā)作用。而在促生長階段則是在培養(yǎng)皿中接種細胞后先以N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍為引發(fā)劑接觸細胞，再接觸受試物，在實驗?zāi)⒓毎潭ㄈ旧偻ㄟ^檢測細胞形態(tài)學(xué)的改變來判斷受試物的促生長作用。

據(jù)文獻報道，與動物體內(nèi)致癌實驗相比，在對184種化學(xué)物質(zhì)的檢測中，BALB/c3T3細胞轉(zhuǎn)化實驗?zāi)軌驒z測出66%有機致癌物和87%無機致癌物，假陽性率為7.6%［3］。說明其與動物體內(nèi)致癌實驗相比，具有很好的一致性。Bhas 42細胞是轉(zhuǎn)染了v-Ha-ras基因的BALB/c3T3細胞，正常情況下由于自身擁有敏感的接觸抑制，在其覆蓋滿培養(yǎng)皿后會停止分裂增殖。若培養(yǎng)過程中接觸致癌物質(zhì)，則會失去細胞間的接觸抑制并以異常的細胞形態(tài)最終形成集落。2004年，Ohmori等［4］提出單獨使用Bhas 42細胞作為檢測化合物的癌癥促進能力的細胞轉(zhuǎn)化實驗;2005年，Asada等［5］改變了細胞接種濃度和受試物加入時間，從而建立Bhas 42二階段細胞轉(zhuǎn)化實驗。其第一期與BALB/c3T3二階段細胞轉(zhuǎn)化實驗中的第一期原理相似，但是在第二階段中減少了引發(fā)物誘導(dǎo)的過程，直接接種接近細胞融合(nearconfluent)濃度的細胞進行實驗。

前期實驗結(jié)果顯示，Bhas 42細胞在引發(fā)實驗檢測中已知的引發(fā)物3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene，MCA)的實驗結(jié)果為陽性，而已知的促癌物佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)的作用為陰性;同時在促生長實驗中TPA的實驗結(jié)果為陽性，而MCA的實驗結(jié)果為陰性［6］。本研究中選定3種化學(xué)品，采用Bhas 42轉(zhuǎn)化細胞檢測其引發(fā)及促生長作用，并與已知的遺傳毒性實驗結(jié)果進行對比，以進一步驗證Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗對于致癌物質(zhì)檢測的準確性。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

EMEM培養(yǎng)基，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)，MCA和TPA購自Sigma公司;DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)和胰酶(含0.25%EDTA)購自Gibco公司;絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)購自Roche公司;氨芐西林鈉(ampicillin Na)購自華美生物工程有限公司;二甲亞砜(DMSO)和吉姆薩色素購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 細胞及培養(yǎng)

Bhas42細胞，購自Japan Health Sciences Foundation，Health Science Research Resources Bank(PO JCRB0149);用含有10%FBS的EMEM培養(yǎng)基(M10F)，5%CO2，37℃恒溫條件下培養(yǎng);生長穩(wěn)定后用含有5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(DF5F)，5%CO2，37℃恒溫條件下培養(yǎng)。

1.3 細胞毒性實驗確定藥物濃度

24孔板，采用DF5F培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整至2×107L－1，每孔加入0.5 ml細胞懸液，接種當(dāng)日為第0天。第3天換成含有受試物的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3個孔。第7天時使用10%甲醛固定30 min，水洗，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，水洗后放入37℃烘箱干燥。每孔加入0.5 ml提取液(0.9%檸檬酸鈉+鹽酸0.02 mol·L－1+50%乙醇)，于波長540 nm處讀取的各組吸光度值，各濃度組與空白對照組的吸光度的百分比值代表細胞存活率。本實驗選取存活率為70%的濃度作為實驗中各受試物的最終濃度，當(dāng)存活率未出現(xiàn)明顯下降時，則選取細胞毒性實驗中的最高濃度。

1.4 引發(fā)實驗

用DF5F培養(yǎng)基調(diào)細胞密度為4×106L－1，每孔加入2 ml細胞懸液，每個受試物采用一塊6孔板，并平行設(shè)置空白對照，接種當(dāng)日為第0天。第1天，將培養(yǎng)基換成含有相應(yīng)受試物的DF5F培養(yǎng)基，空白對照板換成含有0.5%DMSO的DF5F培養(yǎng)基(DF5F中DMSO的比例與受試物組相同)。第4天，換為DF5F培養(yǎng)基并持續(xù)培養(yǎng)至第21天，其中第7天，第11天，第14天更換培養(yǎng)基。第22天時，甲醇固定細胞10 min后，用5%吉姆薩色素溶液染色30 min，計數(shù)細胞集落數(shù)。

1.5 促生長實驗

用DF5F培養(yǎng)基調(diào)細胞懸液密度2×107L－1，每孔加入2 ml細胞懸液，每個受試物采用一塊6孔板，并平行設(shè)置空白對照，接種當(dāng)日為第0天。第4天，將培養(yǎng)基換成含有相應(yīng)受試物的DF5F培養(yǎng)基，空白對照板換成含有0.5%DMSO的DF5F培養(yǎng)基(DF5F中DMSO的比例與受試物組相同)連續(xù)培養(yǎng)至第14天，其中第7天，第11天更換含有受試物或0.5%DMSO的DF5F培養(yǎng)基。第15天換為DF5F培養(yǎng)基并持續(xù)培養(yǎng)至第21天。第22天時，甲醇固定細胞10 min后，用5%吉姆薩色素溶液染色30 min，計數(shù)細胞集落數(shù)。

1.6 引發(fā)和促生長實驗結(jié)果判斷及評價標(biāo)準

根據(jù)集落的嗜堿性程度、細胞的密度及多層性、集落邊緣細胞的方向?qū)D(zhuǎn)化后的細胞進行評價，大于50個細胞才可記為一個集落。計數(shù)集落個數(shù)后采用單側(cè)Dunnett t檢驗進行統(tǒng)計［7］:①受試物組集落數(shù)多于空白對照組，且在單側(cè)Dunnett t檢驗中P＜0.05;②受試物組與空白對照組的集落數(shù)平均值比值大于2。同時符合上述中的兩條即可判斷為陽性(+)，僅符合第一條為可疑結(jié)果(±)，否則判斷為陰性(－)。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C和氨芐西林鈉對細胞存活率的影響

根據(jù)細胞毒性實驗結(jié)果(圖1A，B，C)，CP、MMC和氨芐西林鈉正式實驗的終濃度分別為1750，1300和0.01 mg·L－1。根據(jù)文獻報道及前期實驗結(jié)果，引發(fā)物MCA實驗終濃度為1 mg·L－1，促癌物TPA實驗終濃度為0.05 mg·L－1。

Fig.1 Effect of cyclophosphamide(A)，mitomycin C(B)and ampicillin Na(C)on cell survical.The cells incubated with drugs for 4 d.

2.2 環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C和氨芐西林鈉對集落數(shù)的影響

引發(fā)實驗結(jié)果顯示(表1)，與空白對照組相比，化學(xué)品MCA，MMC及CP的集落平均數(shù)大于空白對照組的2倍，且統(tǒng)計結(jié)果顯示有顯著性差異(P＜0.05)，根據(jù)1.6項中的判定標(biāo)準，MCA，MMC及CP為具有引發(fā)作用的致癌化學(xué)品。與空白對照組相比，氨芐西林鈉的集落平均數(shù)小于空白對照組的2倍，且統(tǒng)計結(jié)果顯示無顯著性差異，按照判定標(biāo)準說明氨芐西林鈉不具有引發(fā)作用。

促生長實驗結(jié)果顯示(表2)，與空白對照組相比，化學(xué)品氨芐西林鈉、MMC及CP的集落平均數(shù)小于空白對照組的2倍，且統(tǒng)計結(jié)果顯示無顯著性差異，根據(jù)1.6項中的判定標(biāo)準，氨芐西林鈉、MMC及CP不具有促生長作用。與空白對照組相比，化學(xué)品TPA的集落平均數(shù)大于空白對照組的2倍，且統(tǒng)計結(jié)果顯示有顯著性差異(P＜0.05)，根據(jù)1.6項中的判定標(biāo)準TPA為具有促生長作用的致癌化學(xué)品。

Tab.1 Effect of cyclophosphamide(CP)，mitomycin C(MMC)and ampicillin Na on foci number in Bhas 42 cell initiation assay

Tab.2 Effect of CP，MMC and ampicillin Na on foci number in Bhas 42 cell promotion assay

與這些藥物已知的Ames檢測［3］、ML［3］、體內(nèi)外染色體畸變［3］和MN［3］結(jié)果相比對(表3)發(fā)現(xiàn)，Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗不僅可以檢測出以上實驗中陽性結(jié)果的化學(xué)品如MCA，MMC和CP以及陰性結(jié)果的化學(xué)品(如氨芐西林鈉)，并可檢測出Ames結(jié)果為陰性而實際有致癌風(fēng)險的化學(xué)品(如TPA)，根據(jù)文獻報道TPA是已知的可導(dǎo)致小鼠皮膚癌的促癌物［8－9］。根據(jù)本實驗的結(jié)果，Bhas 42細胞對化學(xué)品致癌作用的判定與國際癌癥研究中心對致癌物質(zhì)的分類結(jié)果一致。

Tab.3 Comparison of results in the Bhas 42 cell transformation assay with those in genotoxicity assays

3 討論

通過本實驗結(jié)果可知，Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗對于化學(xué)品的致癌作用檢測結(jié)果準確性較高，是一種成本低、周期短、化學(xué)品消耗少且能夠檢測非遺傳性致癌化學(xué)品的體外替代模型。在藥物研發(fā)早期可以用于檢測化學(xué)品致癌性從而進行早期篩選，在進行化學(xué)品致癌作用機制研究時也可用于化學(xué)品致癌作用的類型分析和判斷。目前已有日本學(xué)者采用DNA微陣列和實時RT-PCR技術(shù)，通過細胞轉(zhuǎn)化實驗篩選出22個相關(guān)基因(這些基因全部與細胞分裂周期、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、抗凋亡、正性調(diào)節(jié)細胞增殖有關(guān))，并認為這22個基因標(biāo)志物可作為檢測促癌劑的一個有效工具［10］，這也是基于體外篩選模型對致癌作用機制工作的進一步探索。

當(dāng)然，在致癌評價中哺乳動物長期致癌實驗仍是經(jīng)典實驗方法。體外轉(zhuǎn)化實驗的終點仍屬形態(tài)轉(zhuǎn)化或惡性前期轉(zhuǎn)化，此種轉(zhuǎn)化可能發(fā)展為真正的腫瘤，也可能停滯在此階段，不繼續(xù)惡化。因此對體外轉(zhuǎn)化實驗陽性結(jié)果僅提示受試物有致癌可能性。作為體外實驗檢測體系，Bhas 42細胞轉(zhuǎn)化實驗還需要更進一步的驗證后才能被廣泛認可，今后可聯(lián)合多個實驗室針對多種化學(xué)品進行聯(lián)合驗證以取得更多的數(shù)據(jù)。這將是一個長期而艱巨但是充滿希望的工作。

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Carcinogenesis activity detection of cyclophosphamide，mitomycin C and ampicillin Na by cell transformation assay in Bhas 42 cells

SONG Zheng1，LIU Quan-hai2，MA Jing1
(1.National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation＆Research，Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，China State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai201203，China;2.Department of Pharmacology，Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，China State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai200083，China)

OBJECTIVETo detect the initiating and promoting carcinogenicity activity of some genotoxic chemicals，to evaluate the performance of Bhas 42 cell transformation assay for the detection of chemical carcinogenicity.METHODS①The dose of cyclophosphamide(CP)，mitomycin C(MMC)and ampicillin Na applicable to the Bhas 42 cell transformation assay by cytotoxicity test was defined.②Initiation assay:the day of seeding cells was defined as the day before drug，on the 1st day，medium in each well was changed with the medium DF5F containing test chemical or 0.5%DMSO，and the treatment in the initiation phase was continued for 72 h.Following the exposure period，all treatment media were removed and the cells were refed with medium without the test chemical(the 4th day)and subsequently cultured in DF5F until the 21st day，receiving medium exchanges at the 7th day，the 11th day and the 14th day.The cells were fixed and stained on the 22nd day and counted the foci whose cells number was more than 50.③Promotion assay:the day of seeding cells was defined as the day before drug.On the 4th day，medium in each well was changed with the medium DF5F containing test chemical or 0.5%DMSO，and the treatment in the promotion phase was continued to the 14th day.During the exposure period，all treatment media were replaced with medium containing the test chemical or 0.5%DMSO on the 7th day and the 11th day.The cells were then subsequently cultured in the DF5F without the test chemical from the 15th day to the 21st day.The cells were fixed and stained on the 22nd day and counted the foci whose cells number was more than 50.RESULTSAccording to the results of cytotoxicity test and previous results，the final concentration of chemicals were ampicillin Na:1750，CP:1300，MMC:0.01，3-methyl-cholanthrine(MCA):1and 12-O-tetradecamoylphorbol-13acetate(TPA):0.05 mg·L－1.The initiation assay results showed as the foci numbers of MCA，MMC and CP were significant increased in t-test and more than a 2-fold increase as compared with the solvent control，the above chemicals were the initiation positive.The promotion assay results showed as the foci number of TPA was significantly increased in t-test and more than a 2-fold increase as compared with the solvent control，TPA was the promotion positive.CONCLUSIONBhas 42 cell transformation assay can detect not only the positive and negative chemicals but also the false-negative carcinogens.The Bhas 42 cell transformation assay can be used to detect the initiating and promoting carcinogenicity activity of chemicals.

Bhas 42 cell line;initiation;promotion

The project supported by China Eleventh 5-Year Plan Technical Platform for Drug Development(2008ZX09305-006)

MA Jing，E-mail:jma@ncdser.com

R979.1

A

1000-3002(2012)06-0888-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.019

國家十一五重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(2008ZX09305-006)

宋征(1982－)，女，博士研究生，主要從事一般毒理學(xué)及替代致癌實驗研究，Tel:(021)50800333-222，F(xiàn)ax:(021)508012559，E-mail:zsong@ncdser.com

馬璟，E-mail:jma@ncdser.com

2012-01-06接受日期:2012-04-09)

(本文編輯:喬虹)