模擬失重對大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響

張 雯，唐合蘭，李 靜，陳 英，杜 斌，韓全利，楊春敏中國人民解放軍空軍總醫(yī)院東樓消化科，北京 100142

模擬失重對大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響

張 雯，唐合蘭，李 靜，陳 英，杜 斌，韓全利，楊春敏
中國人民解放軍空軍總醫(yī)院東樓消化科，北京 100142

目的探討模擬失重對乙酸誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響及可能機(jī)制。方法32只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即尾部懸吊7 d組、尾部懸吊14 d組和相應(yīng)的同步對照組。采用乙酸燒灼法制備大鼠慢性胃潰瘍模型，造模后第3天懸吊組大鼠采用尾懸吊法建立模擬失重動物模型。游標(biāo)卡尺檢測胃潰瘍面積，生化比色法測定大鼠血清中丙二醛(MDA)含量，超氧化物岐化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。結(jié)果與對照7 d組相比，懸吊7 d組大鼠潰瘍面積顯著增大(t=5.661，P＜0.01);與對照14 d組比較，懸吊14 d組潰瘍面積顯著增大(t=4.233，P＜0.01)，血清MDA含量及SOD活性顯著增高(t=2.641，P＜0.05，t=5.758，P ＜0.01);與懸吊7 d組比較，懸吊14 d組潰瘍面積顯著減小(t=3.805，P ＜0.01)，血清 MDA 含量及 SOD 活性顯著增高。血清GSH-PX活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論模擬失重可加重潰瘍氧化應(yīng)激反應(yīng)，延遲潰瘍愈合。

模擬失重;實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍;氧化應(yīng)激

隨著載人航天事業(yè)的迅速發(fā)展，對于失重狀態(tài)下航天員各個組織器官的生理功能變化的研究顯得越來越重要，國內(nèi)外的研究主要集中于骨骼、肌肉、心血管、神經(jīng)、免疫等［1-5］，在消化系統(tǒng)方面的研究相對較少。胃黏膜在化學(xué)物質(zhì)作用或缺血等情況下可產(chǎn)生大量的自由基［6］，過量的自由基可以引起胃黏膜或黏膜細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，導(dǎo)致潰瘍發(fā)生，清除自由基不但能防止胃黏膜損傷，還可促進(jìn)損傷的修復(fù)。故推測，失重是否參與消化性潰瘍氧化應(yīng)激反應(yīng)的過程，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)或者抑制抗氧化能力?本實(shí)驗(yàn)研究模擬失重對大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍愈合過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制，為將抗氧化防護(hù)用于治療航天員消化性潰瘍病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 清潔級成年健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量200～230 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分為四組:模擬失重7 d組、14 d組和相應(yīng)的同步對照組，每組8只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，每組大鼠均單籠飼養(yǎng)，自由飲食及水，動物室室溫維持在23℃ ±2℃，12 h循環(huán)光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑 模擬失重模型專用鼠籠(航天醫(yī)學(xué)工程研究所)，動物手術(shù)器械，游標(biāo)卡尺，SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒、GSH-PX測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，戊巴比妥鈉，慶大霉素，100%乙酸。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠慢性胃潰瘍模型制備:每組參照 Okabe方法［7］造模，大鼠造模前24 h禁食不禁水，2%戊巴比妥鈉2.3 mL/kg腹腔麻醉。腹部剃毛、消毒，于劍突下腹正中線打開腹腔，手術(shù)切口長約2 cm，暴露出胃，將內(nèi)徑約5 mm，長約30 mm的硅膠管緊貼在胃前壁漿膜面胃小彎角切跡下方約5 mm處(避開血管)，向管內(nèi)注入100%的乙酸0.1 mL，1 min后迅速吸去殘存的乙酸，用生理鹽水沖洗受乙酸侵蝕的胃壁，將大網(wǎng)膜縫在乙酸涂抹處表面，縫合腹壁。

1.3.2 大鼠模擬失重模型制備:造模后第3天懸吊組大鼠開始尾部懸吊。參照陳杰等［8］的方法采用尾懸吊法建立模擬失重模型。每只吊籠內(nèi)1只大鼠，尾部懸于籠頂，使大鼠前肢踏于籠底的塑料棒上，后肢懸空，身體縱軸與水平面成30°，自由采食和飲水。對照組除不懸吊外，其他條件與模擬失重組相同。

1.3.3 標(biāo)本處理:懸吊7 d和14 d后，各組大鼠禁食24 h，2%戊巴比妥鈉2.3 mL/kg腹腔麻醉，立即剖開腹壁，分離腹主動脈，采血約5 mL，靜置后離心，3 500 r/min，20 min，分離出血清，置EP管中，于 －80℃冰箱內(nèi)保存，留待MDA含量、SOD及GSH-PX活性測定。

1.3.4 潰瘍面積的測定:懸吊組大鼠分別懸吊7 d和14 d后，禁食24 h，2%戊巴比妥鈉2.3 mL/kg腹腔麻醉，剖開腹壁，結(jié)扎賁門、幽門，注入2%福爾馬林溶液10 mL，取出全胃，拭去表面附著物，置2%福爾馬林溶液中。30 min后，沿大彎剪開展平，生理鹽水沖去胃內(nèi)容物。用游標(biāo)卡尺(精確度0.02 mm)測量通過潰瘍中心的最大縱徑和橫徑，分別記為d1、d2。根據(jù)公式，潰瘍面積S=π×(d1/2)×(d2/2)，π取3.14，計(jì)算潰瘍面積。

1.3.5 MDA含量、SOD及GSH-PX活性測定:采用生化比色法測定大鼠血清中SOD(羥氨法)、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX(二硫代二硝基苯甲酸法)、MDA(硫代巴比妥酸法)，操作步驟按測試盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尾部懸吊大鼠GU潰瘍面積的變化 與對照7 d組比較，懸吊 7 d組潰瘍面積明顯增大(6.0 mm2±1.7 mm2vs 2.2 mm2±0.7 mm2，t=5.661，P ＜0.01);與對照14 d組比較，懸吊14 d組潰瘍面積明顯增大(3.0 mm2± 1.2 mm2vs 1.1 mm2± 0.4 mm2，t=4.233，P ＜0.01);與懸吊 7 d組比較，懸吊 14 d組潰瘍面積明顯減小(3.0 mm2±1.2 mm2vs 6.0 mm2±1.7 mm2，t=3.805，P ＜0.01)，但仍較對照 7 d 組大。

2.2 尾部懸吊大鼠血清MDA含量的變化 與對照14 d組比較，懸吊14 d組MDA含量顯著增高(t=2.641，P ＜0.05);與懸吊 7 d組比較，懸吊 14 d組MDA 含量顯著增高(t= －2.353，P ＜0.05，見表1)。

2.3 尾部懸吊大鼠血清SOD活性的變化 與對照14 d組比較，懸吊14 d組 SOD活性顯著增高(t=5.758，P ＜0.01);與懸吊7 d組比較，懸吊14 d組 SOD活性顯著增高(t= －4.320，P ＜0.01，見表1)。

2.4 尾部懸吊大鼠血清GSH-PX活性的變化 對照7 d組、14 d組分別與懸吊7 d組、14 d組比較，GSHPX活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。

表1 各組大鼠血清MDA含量、SOD及GSH-PX活性的比較(± s，n=8)Tab 1 Comparison of MDA level，SOD and GSH-PX activity in serum among rats of each group(± s，n=8)

表1 各組大鼠血清MDA含量、SOD及GSH-PX活性的比較(± s，n=8)Tab 1 Comparison of MDA level，SOD and GSH-PX activity in serum among rats of each group(± s，n=8)

與對照14 d組比較，cP＜0.05，dP＜0.01;與懸吊7 d組比較，eP＜0.05，fP ＜0.01

組別MDA(mmol/L)SOD(U/mL)GSH-PX(U/mL)對照7 d組3.046 ±0.266 66.389 ±1.489 740.670 ±52.913懸吊7 d 組 2.856 ±0.567 66.552 ±2.203 738.022 ±69.990對照14 d組 2.748 ±0.365 65.170 ±1.006 827.977 ±54.859懸吊14 d組 3.693 ±0.818ce 72.633 ±3.526df 795.714 ±88.735

3 討論

胃黏膜具有豐富的血供，在各種應(yīng)激反應(yīng)、胃黏膜缺血或化學(xué)物質(zhì)作用時(shí)，可產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞凋亡率增加，加重胃黏膜損害和促進(jìn)潰瘍形成。此外，在許多種系中，胃腸道黃嘌呤脫氫酶的含量遠(yuǎn)高于其他任何組織，故一旦有條件，胃腸黏膜將產(chǎn)生大量氧自由基［9-10］。SOD、GSH-PX及MDA是目前公認(rèn)的較好反映體內(nèi)自由基損傷的指標(biāo)。乙酸燒灼法誘導(dǎo)的胃潰瘍模型，主要是通過外源性酸直接腐蝕胃壁組織，使胃黏膜局部微循環(huán)障礙，胃黏膜組織缺血、缺氧，壞死脫落，造成潰瘍形成。

許多研究證明空間飛行會增加機(jī)體的氧化應(yīng)激水平［13-14］。尾吊模擬微重力效應(yīng)導(dǎo)致了大鼠小腦、大腦皮層和海馬組織的氧化應(yīng)激［15］;大鼠尾懸吊模擬失重使大鼠腦組織脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物MDA、4-HNE增加［16］;3周模擬失重可增加大鼠的心肌氧化應(yīng)激水平，抗氧化能力下降［17］;模擬失重通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)元起始大鼠PC12細(xì)胞衰老［18］。雖然機(jī)體受到應(yīng)激后，產(chǎn)生的自由基大量增加，氧化作用加強(qiáng)，同時(shí)清除自由基系統(tǒng)的抗氧化酶系統(tǒng)活性也出現(xiàn)代償性增大，但隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，該系統(tǒng)活性呈消耗性降低［19］。研究顯示，失重早期機(jī)體自身抗氧化能力增強(qiáng)，使機(jī)體脂質(zhì)過氧化相對穩(wěn)定，隨著失重時(shí)間的延長，機(jī)體產(chǎn)生氧自由基增加，抗氧化能力下降，從而使機(jī)體脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)［20］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，懸吊組大鼠潰瘍面積明顯大于相應(yīng)對照組，說明模擬失重使大鼠潰瘍愈合延遲。懸吊14 d組與對照14 d組相比，SOD活性顯著增高，反映黏膜脂質(zhì)過氧化的 MDA含量增高，提示模擬失重使機(jī)體氧自由基產(chǎn)生增多，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，機(jī)體清除自由基能力出現(xiàn)代償性升高。與懸吊7 d組相比，懸吊14 d組SOD活性顯著增高，MDA含量增高，表明隨著模擬失重時(shí)間的延長，機(jī)體氧化應(yīng)激加重。懸吊組7 d組、14 d組與對照組相比，GSH-PX活性雖降低但無明顯差異，懸吊14 d組與懸吊7 d組相比，GSH-PX活性雖有增強(qiáng)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于模擬失重初期清除過多過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，消耗使其活性降低，而對于失重應(yīng)激沒有SOD敏感，未出現(xiàn)明顯的代償性增加。提示本模型中，胃黏膜抗氧化能力代償性增高主要與SOD活性增高有關(guān)，與GSH-PX變化無明顯關(guān)系。氧化和抗氧化共同作用于潰瘍修復(fù)的整個過程。潰瘍形成后，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤，組織局部大量炎癥介質(zhì)的釋放，在潰瘍局部產(chǎn)生大量的氧自由基，通過多種機(jī)制引起組織和細(xì)胞的氧化損傷。模擬失重則加重了潰瘍機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使自由基產(chǎn)生增多，雖然抗氧化系統(tǒng)如SOD出現(xiàn)代償性增加，但并未能完全拮抗增多的氧自由基，氧化代謝產(chǎn)物增多，胃黏膜損害加重。

綜上所述，大鼠尾部懸吊模擬失重導(dǎo)致胃黏膜氧化應(yīng)激水平增加，抗氧化能力降低，這可能是胃潰瘍愈合延遲的因素之一。加用抗氧化劑可減少氧自由基的產(chǎn)生，進(jìn)而減少胃黏膜細(xì)胞的凋亡，起到保護(hù)胃黏膜的作用［21］。因此，加強(qiáng)胃黏膜對氧自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的清除能力，對模擬失重狀態(tài)下增強(qiáng)胃潰瘍愈合起到積極作用。

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Effect of simulated weightlessness on oxidative stress status of experimental gastric ulcer in rats

ZHANG Wen，TANG Helan，LI Jing，CHEN Ying，DU Bin，HAN Quanli，YANG Chunmin
Department of Gastroenterology，East Building，General Hospital of Air Force，PLA，Beijing 100142，China

ObjectiveTo investigate the effect of simulated weightlessness on oxidative stress status of acetic acidinduced experimental gastric ulcer in rats and to explore potential mechanisms.MethodsThirty-two SD rats were randomly and equally divided into four groups:7 d tail suspension group，7 d control group，14 d suspension group and 14 d tail control group.Gastric ulcer was induced in rats by acetic acid.Tail suspension was used to simulate the weightlessness condition 3 days after ulcer induction.The gastric ulcer area was measured with a vernier caliper.Malondialdehyde(MDA)level，superoxidatase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)activity in serum were determined by biochemical assay，respectively.ResultsCompared with the 7 d control group，the ulcer area significantly increased(t=5.661，P ＜0.01)in the 7 d suspension group.Compared with the 14 d control group，the ulcer area，MDA level and SOD activity significantly increased(t=4.233，P ＜0.01;t=2.641，P ＜0.05;t=5.758，P ＜0.01)in the 14 d suspension group.Compared with the 7 d suspension group，the ulcer area significantly decreased(t=3.559，P ＜0.01)，MDA level and SOD activity significantly increased in the 14 d suspension group.The difference of GSH-PX activity in serum was insignificant on statistics.ConclusionSimulated weightlessness may augment the oxidative stress in rats ulcer.

Simulated weightlessness;Experimental gastric ulcer;Oxidative stress

R573.1

A

1006-5709(2012)03－0268－03

2011-11-01

全軍十一五科技攻關(guān)項(xiàng)目(08G045)

楊春敏，E-mail:chunmyang@sina.com

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